Иммуноферментный анализ и его использование в ветеринарии

Для диагностики инфекционных болезней животных применяются различные методы исследований, в том числе серологические и иммунохимические, основанные на реакции антиген-антитело. Главным компонентом иммунохимической реакции являются антитела (иммуноглобулины) – белки сыворотки крови, которые синтезируются в организме как проявление защитной реакции при попадании чужеродного вещества – антигена. Антитела представляют собой крупные белковые молекулы, состоящие из двух легких (L) и двух тяжелых (H) полипептидных цепей с Мм 22000 и 50000-70000 Да соответственно. Различают 5 классов иммуноглобулинов IgM, IgG, IgA, IgD, IgE, которые отличаются по Мм, размерам Н-цепей, последовательности аминокислот, углеводными компонентами, положению и количеству дисульфидных связей. Все γ-глобулины (антитела) имеют вариабельные участки – активные центры антител. Одна молекула антител может иметь несколько активных центров, способных специфически связываться с антигеном. Активный центр имеет уникальную специфичность, обеспечивающую тесную связь с антигеном, напоминающий соответствие между рукой и перчаткой, или ключом и замком.

В качестве антигенов могут выступать белки, полисахариды, а также низкомолекулярные соединения: антибиотики, пестициды. Антитела образуются не против всей молекулы чужеродного белка, а только к небольшим участкам на их поверхности – антигенным детерминантам. Антигенными детерминантами белковых молекул чаще всего являются лишь около 5 аминокислотных остатков, а в случае бактериальных клеток в качестве антигенных детерминант выступают короткие цепи из 3-5 остатков сахаров, образующих стенки бактериальных клеток. Низкомолекулярные соединения (гаптены) могут образовать антитела лишь после соединения с макромолекулами.

Для получения специфических иммуноглобулинов (антител) применяются различные методы иммунизации мелких (мыши, морские свинки, кролики, куры) и крупных (овцы, козы, лошади) животных. Принципиально новый метод получения антител – это метод гибридом.

Для диагностики инфекционных болезней разработаны высокочувствительные методы – радиоиммунный и иммуноферментный. Радиоиммунный метод требует сложной аппаратуры, радиоактивных соединений, в частности J¹²⁵, что связано с рядом ограничений, а потому неприемлим в обычных условиях.

Иммуноферментный метод не уступает по чувствительности радиоиммунному, может использоваться в различных лабораторных условиях, а некоторые варианты его могут быть применены непосредственно в условиях животноводческих ферм, например, для определения беременности у коров по уровню содержания прогестерона в молоке. Иммуноферментный метод анализа позволяет определить до 10^-14 моля вещества. Принцип метода заключается в том, что при взаимодействии антигена с антителом получается комплекс антиген-антитело. Количество антигена или антитела, вошедшее в комплекс антиген-антитело, может быть определено с помощью фермента, использованного для мечения антигена или антитела в зависимости от поставленной задачи. Сейчас разработаны сотни различных вариантов иммуноферментного анализа на твердом носителе. В этом случае антитела, иммобилизованные на твердой фазе (на иммунологических планшетах из полистирола), реагируют вначале с искомым антигеном (немеченым), а затем остающиеся свободными иммобилизованные антитела связываются с меченным (ферментом) антигеном. Количество связанного с меченным ферментом антигена обнаруживают с помощью соответствующего субстрата. Здесь фермент играет роль маркера, и использование его основано на том, что одна молекула фермента производит много молекул продуктов ферментативной реакции, концентрацию которых можно обнаружить обычными физико-химическими методами или же визуально (по изменению цвета). Иммуноферментный метод используют для выявления иммуноглобулинов, гормонов, вирусных и бактериальных антигенов, лекарственных препаратов, пестицидов и т.д.

Для диагностики инфекционных болезней животных разработаны специальные наборы для диагностики классической чумы свиней, бруцеллеза крупного рогатого скота, бешенства, сибирской язвы, хламидийной инфекции, ротавирусов, инфекционного ринотрахеита и ряда других болезней сельскохозяйственных животных. Использование моноклональных антител делает иммуноферментный анализ еще более ценным, так как при этом в несколько раз повышается его чувствительность и специфичность.