V фермент б /

побочный продукт -•—^ * эстхйиогательный субсграт

Существенным для данного способа регенерации кофермента является различие в специфичности используемых ферментов для исключения возможной конкуренции основных и побочных субстратов и продуктов.

В числе удачных систем регенерации НАД могут быть назва­ны системы лактатдегидрогеназа —■ глутаматдегидрогеназа и лактатдегидрогеназа — алкогольдегидрогеназа. Так, включение последней системы позволяет провести десятки тысяч циклов регенерации НАД.

В последние годы системы сопряженных ферментативных реакции находят все большее применение в тонком органи­ческом синтезе, В качестве примера назовем реакцию окисле­ния стероидов в присутствии 17-р-оксистероиддегидрогеназы. Н2

Для регенерации окисленной формы НАД используется ката­лизируемое лактатдегидрогеназой восстановление пи^увата.

Для придания большей технологичности промышленным про­цессам разрабатываются процессы регенерации, основанные на применении иммобилизованных ферментов и (или) коферментов. Так, процесс регенерации НАД был осуществлен при использо­вании иммобилизованных в полупроницаемых микрокапсулах алкогольдегидрогеназы и малатдегидрогеназы. Наряду с им­мобилизованными ферментами употребляется и иммобилизован­ный НАД, например, связанный с растворимыми производными декстрана.

Для того чтобы система регенерации коферментов была эко­номически выгодной, необходимо понизить стоимость вспомога­тельного субстрата. Это было сделано с применением процес­са на основе формиатдегидрогеназы и НАДН-дегидрогеназы (А. М. Егоров, А. П. Осипов, 1978).

НАЛ

О&осстановненнын) (окисленный)

Неферментативные способы регенерацк НАД(Н) и НАДФ(Н), К неферментативным методам регенерации кофак­торов относятся химические и электрохимические способы. Ввиду своей низкой специфичности они меньше распространены, чем ферментативные.

Химические методы. В качестве химических реагентов для регенерации НАДН находят применение дитионит натрия и некоторые соли пиридиння. Преимущество проведения регенера­ции в присутствии этих веществ заключается в их относи­тельно невысокой стоимости. Однако следует отметить, что и дитионит натрия, и пиридиниевые холи могут являться ингиби­торами ряда ферментов.

В последнее время в качестве реагента для химической регенерации НАД применяется сравнительно дешевый флавин-мононуклеотид (ФМН). Использование этого вещества обуслов­лено тем, что флавиновые коферменты участвуют в процессах регенерации НАД in vivo. Иммобилизация ФМН на полиэти-лени мине приводит к существенному увеличению скорости окис­ления НАДН.

Удобным оказалось применять для регенерации пиридинди-нуклеотидных коферментов различные красители, которые дают возможность определять малые количества коферментов- Среди красителей наиболее употребимы метиленовый голубой, тиазолил

143

голубой, акрифлавин, феназинметосульфат. Так, при использова­нии последнего достигается до 10 000 циклов восстановления кофер мента.

Электрохимические методы регенерации кофер ментов только начинают развиваться. При проведении прямого электрохими­ческого восстановления или окисления кофермента могут возни­кать трудности, связанные с появлением ферментативно неак­тивных форм в результате, например, его димернзации. Для преодоления этих трудностей проводят электрохимическое вос­становление иммобилизованного НАД. В качестве носителя ис­пользуют водорастворимую альгиновую кислоту.

Регенерация АТФ, АТФ — один из важных коферментов, участвующих в ферментативных процессах образования новых химических связей. Для регенерации АТФ применяют следую­щие методы: I — прямой химический синтез из АМФ или АДФ и фосфорной кислоты; 2 — получение АТФ in vivo с использова­нием дрожжей, бактерии, клеточных органелл; 3 — фермента­тивный синтез in vitro.

Химический синтез АТФ. Осуществляется путем фосфорили рования аденозина или АМФ. В качестве фосфорилирующих агентов употребляются фосфор ил хлорид, фосфорная кислота и др. Реакция протекает в органическом растворителе. Хими­ческий метод регенерации АТФ не очень удобен из-за обра­зования побочных продуктов, необходимости применения боль­шого избытка фосфорилирующего агента, в также из-за необ­ходимости дальнейшей очистки АТФ.

Регенерация АТФ с использованием целых- клеток и орга-иелл. Многие клетки и клеточные органеллы содержат Ф^€Р~ менты, катализирующие синтез АТФ из аденозина, АМФ и неорганического фосфата- Так, для регенерации АТФ использу­ются дрожжи, а также субклеточные органеллы, такие, как митохондрии, хлоропласты и хроматофоры. В последние годы для регенерации АТФ начали применять иммобилизованные клетки.

Процесс регенерацит АТФ, происходящий с участием мито­хондрий, может быть в сумме представлен следующим образом:

2НАДН + 2Н+ + 6АДФ + № + O₂ -+ 2НАД+ + 8H₂O + 2 пируват + ЗОАДФ + ЗОР, + 50;-^ 6СО₂ + 34Н₂О 4- ЗОАТФ

К недостаткам этого процесса относятся: 1 — низкая стабиль­ность систем; 2 — необходимость создания дополнительной си­стемы регенерации НАД, участвующего в первой реакции.

Значительно более перспективным в регенерации АТФ яв­ляется использование хроматофоров, способных осуществлять реакцию циклического фосфорилирования. Преимуществом хро-матофоров по сравнению с митохондриями и хлоропластамн

144

является их высокая механическая и химическая стойкость, которая может быть еще увеличена путем иммобилизации хро-матофоров в полиакриламидном геле.

Методы ферментативной регенерации АТФ in vitro. Они полу­чили наибольшее развитие. Среди более чем 100 ферментов, катализирующих перенос фосфатсодержащих групп, наиболее часто применяют полифосфаткиназы (реакции 1) и фосфотранс-феразы (киназы) (реакция 2):

АДФ + (РОГ)* ** АТФ + (РОз )„_ 1 (1)

АД Ф И- ВР, ^ АТФ + Б (2)

где ВР — а ци л фосфат, фосфоенол пиру ват, L-фосфоаргинин

и т. д.

В качестве доноров фосфатной группы ВР в реакции (2) могут принимать участие такие соединения, как ацетнлфосфат, L-фосфоаргннин, 4 фосфо-^-аспартат, карба мил фосфат, креатин-фосфат, 1,3-Дифосфо-О-глицерат, фосфоенолпируват, фосфор-амидат.

При использовании систем регенерации АТФ с участием фосфотра нефе раз удается осуществить практически полную регенерацию этого кофермента (с выходом более 95%).

_{ЗАКЛЮЧЕНИЕ}

Идеи иммобилизации биокаталиэаторов инициировали н стимулировали бурное развитие одного из важнейших направ­лении современной биотехнологии — инженерной энзимологни. Текущая (тактическая) задача инженерной энзимологин — это разработка (конструирование) биоорганических катализаторов с заданными свойствами на основе ферментов (в том числе с использованием пол я ферментных комплексов и даже целых кле­ток). Говоря о «заданных» свойствах, следует понимать, что они продиктованы потребностями практики; это, например» не­обходимое время службы катализатора при определенных усло­виях реакции (что зависит от его термостабильности, чувстви­тельности к тем или иным факторам среды), избирательность (специфичность) действия, производительность (каталитическая активность), иммуногенность, токсичность, геометрическая фор­ма препарата катализатора, его механические свойства и т. д.

Однако рамки инженерной энзимологни гораздо шире, чем создание катализаторов нового типа. Цель этой дисциплины, ее стратегическая задача состоит в том, чтобы разработать научные основы применения ферментативных катализаторов для создания новых биотехнологических процессов в промышлен­ности, новых методов в терапии н медицинской диагностике» анализе, органическом синтезе и в других областях практиче­ской деятельности.

В качестве примера, наглядно иллюстрирующего разработку новых подходов к решению практических задач инженерной энзнмологни с привлечением методов иммобилизации, может служить проблема применения биокатализаторов для проведения реакций органического синтеза в среде органических растворите­лей с низким содержанием воды. Дело в том, что широкое приме нение ферментов в органическом синтезе существенно ограничи­вается тем, что ферменты, как принято считать, способны эффективно функционировать лишь в среде с высоким содержа­нием воды, В то же время в классическом органическом синтезе в качестве реакционной среды нашли применение самые разнооб­разные органические растворители. Имеется несколько карди­нальных причин, которые делают необходимым использование органических растворителей как среды также и для фермента-

146

тивных реакций. Во-первых, при использовании органических растворителей решается проблема растворения гидрофобных реагентов, которая часто представляет трудно преодолимый барьер при проведении реакции в воде. Во-вторых, благодаря использованию органических растворителей термодинамическое равновесие многих ферментативных реакций сдвигается в сторо­ну требуемых продуктов. Прежде всего это относится к тем реак­циям, одним из продуктов которых является вода, в частности, к реакциям синтеза сложноэфирных, пептидных и амидных свя­зей. В-третьих, применение органических растворителей снимает проблему бактериального заражения технологических установок, которая весьма остро стоит при использовании водных раство­ров.

Благодаря этим очевидным преимуществам в последние годы обозначился резко возросший интерес к проблемам биокатализа в неводных средах. Были предложены многочисленные и разно­образные подходы, направленные на конструирование биоката­литических систем, способных функционировать с исключительно малым содержанием воды. С точки зрения круга проблем, обсуж­дающихся в данном пособии, важным является то, что эти подходы в подавляющем большинстве случаев основаны в той или иной степени на различных способах иммобилизации {физи­ческой или химической) биологических катализаторов.

Методические аспекты инженерной энзимологнн во многом определены иммобилизационными подходами. В этой книге были рассмотрены лишь основные принципы получения иммобилизо­ванных ферментов и влияние иммобилизации на свойства полу­чаемых препаратов- Поэтому главная цель пособия будет до­стигнута, если у читателя пробудится интерес к этому разделу биотехнологии и появится желание дальнейшего изучения затро­нутых вопросов.

В заключение отметим, что в целом иммобилизация (как инструмент биотехнологии) сама по себе является достаточно развитой в методическом отношении, в будущем здесь следует ожидать лишь детализации отдельных приемов, а наибольший интерес и перспективы связаны с ее практическим использо­ванием. И в этой связи хотелось обратить внимание, что идеи иммобилизации и ее методология приложимы не только к фер­ментам, но и многим другим соединениям, как высоко-, так и низкомолекулярным (гормонам, витаминам, лекарственным ве­ществам и т. п.)-

_{ПРИЛОЖЕНИЕ}

ПРИМЕРЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ МЕТОДИК

1. Иммобилизация три л си на на целлюлозе. 10 мл 6%-ного раствора периодата натрия смешивают с 0,5 г целлюлозы. Пере­ мешивают смесь в течение 3 ч> затем осадок отделяют и промы­ вают водой. Промытый осадок помещают в 10 мл 0,1 М трисовогО буфера, рН 6Д содержащего 10 мМ СаС1_й для уменьшения авто­ лиза, и добавляют фермент. Количество добавляемого трипсина зависит от его удельной активности и, как правило, это 100 мг- Смесь инкубируют при перемешивании в течение 1— 3 ч. Точное время инкубации устанавливают экспериментально, определяя удельную актшшость нативного трипсина и активность в супер- натанте для расчета количества фермента, связавшегося с но­ сителем. Пробы для измерения активности супериатанта следует отбирать в процессе иммобилизации через каждые 20—30 мин. Полученный препарат иммобилизованного фермента отделяют фильтрованием, промывают буферным раствором и насыщенным раствором мочевины для удаления не связавшегося с носителем фермента. Высушенный на фильтре препарат иммобилизованного трипсина может храниться в течение нескольких месяцев при 4°С практически без потери активности.

2. Определение ферментативной активности иммобилизован­ ного трипсина. Определение проводят, измеряя скорость фермен- тативного гидролиза этилового эфира Ы-бензоил-Ь-аргинина, потенциометрически на рН-стате. Для этого из инкубационной смеси отбирают пробы по 0,5—1,0 мл и помещают в ячейку рН-стата, содержащую 10~³ М субстрата (рН около 7)_т 0,1 М KCI и 10 мМ СаОг- Измеряют активность отобранных проб, учитывая фоновую реакцию гидролиза субстрата в отсутствие фермента.

3. Ковалентная иммобилизация u-хнмотрипсина в полиакрил- амндном геле. Процедура иммобилизации включает две стадии: модификацию хлорангидридом акриловой кислоты и включение в гель.

а) К раствору 5—20 мг химотрипсина в 10 мл 0,2 М фосфат­ного буфера, рН 8,0, при 0°С добавляют 10—100 мкл хлорангид-рида акриловой кислоты порциями по 10 мкл при интенсивном

148

перемешивании. После добавления каждой новой порции хлор-ангидрида акриловой кислоты инкубируют раствор в течение 5 мин, доводят рН до 8,0, добавляя концентрированный раствор КРН: затем вносят новую порцию модификатора. После завер­шения модификации раствор инкубируют при 0°С без перемеши­вания в течение 30 мин.

б) К раствору модифицированного фермента (10мл) после­довательно добавляют 3*33 г акриламида, 0,2 г N,N'-метилен-бис-акрил амида и 0,1 мл 10%-ного водного раствора N_TN,N',N'-тетраметилэтилендиамина, доводят рН до -8,0 концентрированной НС1 и далее добавляют 20 мг персульфата аммония в виде 20%-ного раствора. Раствор быстро (в течение нескольких се­кунд) перемешивают, разливают в тонкостенные стеклянные пробирки диаметром 5 мм и инкубируют в течение суток при 4°С. Полученный гель извлекают из пробирок, измельчают, растирая в ступке, и инкубируют в течение суток в 0,1 М трисовом буфере, рН 8,0, при 20°С. Суспензию переносят на стеклянный фильтр G-2 (пор-100), промывают несколькими объемами дистиллиро­ванной воды, высушивают гель на фильтре в течение нескольких минут. Удельная активность иммобилизованного а-химотрипсина составляет 0,1—0,3 мг фермента на I г геля.

4, Определение активности иммобилизованного а-химотрипси- на„ Определение проводят потенциометрически, измеряя скорость ферментативного гидролиза специфического субстрата этилового эфира N-ацетшг-L-тирозина на рН-стате. Для этого навеску иммобилизованного фермента (0,05—1,0 г) помещают в ячейку рН-стата с 5—10 мл 5 мМ раствора субстрата в 0,1 М КС1 (рН 8,0) н измеряют активность препарата фермента, учитывая фоновую реакцию гидролиза субстрата в отсутствие фермента.

5. Реактивация термоинактивированного иммобилизованного трипсина. Препарат иммобилизованного трипсина (0_т2—1 г) после термоинактивации (остаточная активность 5—15% от уровня активности препарата фермента до термоинактивации) вносят в 4 мл раствора 10 М мочевины (рН 3) и инкубируют в течение 30 мин. Затем доводят рН до 8,5 концентрированным раствором КОН и в суспензию добавляют 1 мл 0,t M раствора трисового буфера (рН 8,5), содержащего 10 мг дитиотреитола — реагента, расщепляющего S—S-связи в белках. Суспензию ин­ кубируют в течение 3 ч при 20°С в атмосфере инертного газа (азота или аргона). После инкубации препарат иммобилизован­ ного трипсина переносят на стеклянный фильтр G-3 (пор-40) и промывают 1 мМ раствором НС! и 5%-ным раствором уксусной кислоты несколько раз порциями по 10—20 мл до исчезновения запаха дитиотреитола. Промывание препарата проводят в токе инертного газа, ее продолжительность не превышает 10—15 мин. Затем препарат помещают в 10 мл 0,1 М раствора трисового буфера (рН 8,0), содержащего 10 мг ЭДТА и смесь глутатионов: 12 мг восстановленной формы и 2,4 мг окисленной формы. Инку­ бацию иммобилизованного препарата в этих условиях проводят

149

в течение 1—2 сут при 20°С При этом происходит реактивация иммобилизованного трипсина на 70—100% от уровня исходной (до иммобилизации) активности фермента.

6. Микрокапсулнрование ферментов в полупроницаемые най~ лоновые оболочки методом межфазной полимеризации. К 0,75 мл 10%-ного раствора полиэтиленимина, рН которого доведен до 9,8, добавляют 0,75 мл 0,38 М раствора 1,6-гексаметилендиамнна в 0,8 М карбонатном буфере, рН 9,8. Раствор перемешивают, охлаждают до 0^уС, растворяют в нем 15 мг и-химотрнпснна. К полученному 1%-ному водному раствору фермента в тефлоно-вом стаканчике объемом 100 мл, помещенном в ледяную баню, добавляют 7,5 мл охлажденной смеси хлороформа и циклогекса-на (1: 5 по объему), содержащей 1% по объему эмульгирующего агента Спан-85. Эмульгируют водный раствор фермента в орга­ническом растворителе на магнитной мешалке при 0°С в течение 1 мин. Размер капсул определяется скоростью перемешивания и концентрацией Спан-85 — стабилизатора эмульсии.

К полученной эмульсии типа «вода в масле», не прекращая перемешивания, добавляют 7,5 мл охлажденного 18 мМ раствора себацнлхлорида в вышеназванной смеси органических раство­рителей. Раствор себаци л хлорида готовят непосредственно перед употреблением путем растворения 0,03 мл дихлорида в 7,5 мл смеси растворителей. В результате диффузии 1,6-гексаметилен-днамнна из волной в органическую фазу на поверхности раздела фаз образуется полимерная мембрана. Реакцию образования по­лимерной мембраны на поверхности эмульсионных капелек про­водят в течение 3-^5 мин при перемешивании. Для прекращения реакции полимеризации к суспензии микрокапсул добавляют 15 мл вышеназванной смеси органических растворителей.

Полученную суспензию микрокапсул разливают в две центри­фужные пробирки и добавляют в каждую по 10 мл 15%-кого рас­твора Спан-85 в смеси хлороформа н циклогексана в объемном соотношении 1 :3. Суспензию перемешивают палочкой и центри­фугируют при 8000 об/мин в течение I—2 мин, супернатант уда­ляют.

Микрокапсулы диспергируют в 15 мл 50%-кого водного рас­твора Твнн-20 на магнитной мешалке в течение 1 мин при макси­мальной скорости перемешивания. К полученной суспензии пор­циями добавляют 130 мл воды при перемешивании на магнитной мешалке в 0,5 л стеклянном стакане {по мере добавления воды постепенно снижают скорость перемешивания).

Суспензию центрифугируют при 8000 об/мин в течение 2— 3 мин. Супернатант удаляют, микрокапсулы промывают раство­ром НО, рН 3,0, до исчезновения ферментативной активности в фильтратах. Полученные микрокапсулы хранят в виде суспензии в 1 мМ НС1 при 4^СС. Размеры полученных микрокапсул 10— 15 мкм.

7. Ми крокапсулнро вание ферментов в поликарбонатные обо­лочки методом двойного эмульгирования. К Юмл 10%-ного

150

шта в метилен хлориде при интенсивном перемешивании быстро по каплям добавляют 2 мл 1%-ного вод­ного раствора фермента {рН 3,0), содержащего 5% полиэтилен-амина. Эмульгирование проводят в течение 1 мин. К полученной первичной эмульсин, не прекращая перемешивания, постепенно приливают 50 мл 2%-ного раствора поливинилового спирта — стабилизатора эмульсии в 0,5 JVL ацетатном буфере, рН 4 J. Про* должают перемешивание в течение 2,5—3 ч при комнатной тем­пературе. За это время метилен хлорид полностью испаряется, н на поверхности водных капелек фермента образуется твердая полупроницаемая полимерная оболочка- Микрокапсулы отделяют и промывают 1 мМ раствором HCI на воронке со стеклянным пористым фильтром.

8. Солюбилнэация ферментов в обращенные мицеллы поверх­ ностно-активных веществ в органических растворителях. К 2 мл 0,1 М раствора Аэрозоля ОТ в октане добавляют 5—150 мкл 10—50 мМ водного буферного раствора, рН 3—11 (концентрация не должна превышать 50 мМ, при наличии высокой ионной силы следует использовать буферный раствор с более низкой концен­ трацией) . Смесь интенсивно встряхивают до образования опти­ чески прозрачного раствора. Для ускорения процесса образова­ ния прозрачного раствора, содержащего большие количества буферного раствора, добавляют буферный раствор порциями по 2—3% (40 -G0 мкл). Далее добавляют Б— 20 мкл водного раствора фермента и опять интенсивно встряхивают до образо­ вания оптически прозрачного раствора. Фермент можно вносить н в виде навески сухого обессоленного порошка, однако время растворения фермента в этом случае в системе обращенных мицелл с низким содержанием воды (меньше 2%) существенно увеличивается (от нескольких десятков секунд при внесении водного раствора белка до десятков минут и даже часов при внесении сухого белка). Для солюбнлизации белка и опре­ деления активности включенного фермента наиболее широко используются растворы Аэрозоля ОТ в октане в концентрациях от 30 до 300 мМ,

9. Получение нанегранулированного смшмотрипсина. К 5 мл 0,235 М раствора Аэрозоля ОТ в толуоле добавляют 100 мг акриламнда н 25 мг Ы,Ы'-метнлен-бнс-акриламнда в 200 мкл воды и инициатор радикальной полимеризации, азо-бис-изобу- тиронитрил, из раечсти О, i мг/мл Смесь встряхивают в течение 15—30 мин до полной солюбилизацни. Затем к полученному раствору добавляют 100 мкл концентрированного (0,5 мМ) вод­ ного раствора акрнлоилнрованного сс-хнмотрнпсина (см. его получение в примере 3) и после встряхивания получают одно­ родный прозрачный раствор обращенных мицелл Аэрозоля ОТ в толуоле, содержащий солюбилизованные мономеры.

Полимеризацию инициируют облучением деаэрированного мицеллярного раствора УФ-светом (ксеионовая лампа ХВО-200, расстояние от источника 33 см, толщина слоя раствора 1см).

151

Для завершения полимеризации облучение продолжают в тече­ние 10 мин.

После проведения полимеризации мнцеллярную систему раз­рушают добавлением 10-кратного избытка ацетона. При этом по­лимерные наногранулы (размер менее 100 нм в диаметре) выпа­дают в осадок, а растворимые в ацетоне непрореагировавшие мономеры и Аэрозоль ОТ удаляют с супернатантом. Полученный сухой порошок наногранулированного а-хнмотрипснна обладает до 40—60% ферментативной активности (от исходной), может храниться практически без потери активности в течение полугода при 4°С, растворим как в воде, так и в мицеллярных растворах в органических растворителях.

10, Гидрофобнзацнн белков (на примере сс-хнмотрипснна) для целей нековалентной иммобилизации на гидрофобных носителях (биомембранах). К 10 мл 0,1 М раствора Аэрозоля ОТ в октане добавляют 450 мкл 33 мМ боратного буфера, рН 9,0. Раствор интенсивно встряхивают в течение I—2 мин, солюбнлизуют в нем 20—50 мг препарата лиофилизованного фермента, затем добав­ляют —100 мкл раствора стеароилхлорида в 0,1 М Аэрозоле ОТ в октане (соотношение стеароил хлорид — белок составляет 2:1). Раствор перемешивают в течение 20—30 мин,

Из реакционной системы белок осаждают на холоду добавле­нием двойного объема ацетона, выпавший осадок белка отделяют и встряхивают с 20 мл холодного ацетона для отмывки от приме­сей октана и Аэрозоля ОТ. Эту операцию повторяют 2—3 раза. Остаток ацетона удаляют на роторном испарителе (18°С) или током воздуха. Выход по белку контролируют по массе н спектро-фотометрнческн (280 нм).

Фракционирование стеароилированного химотрипсина прово­ дят на колонке (объем 210 мл) с сефядексом G-50, уравновешен­ ным I мМ НС1. И-л колонку наносят 10—20 мл 20 мкМ раствора белка» рН ЗД Гидрофильную фракцию элюируют I мМ HCl_t гидрофобную — 0,5%-ным раствором Бридж 35, рН ЗД Выход модифицированного белка составляет %

_{ЛИТЕРАТУРА}

Основная:

Введение в прикладную энзимол огню/Под ред. И. В. Березина и К. Марти-неха. — М.: Изд-во МГУ, 1962. 384 с.

Иммобилизованные ферменты //Современное состояние и перспективы /Под ред. И В. Березина, В. К. Антонова и К. Мартннека.— М.: Изд~во МГУ, 1976, Т. U 2. 296 с: 358 с.

Тривен М. Иммобилизованные ферменты.—М.: Мир, 1983. 213 с.

Лурье А. А. Хромат о графические материалы. ■— М.: Химия, 1978.

Коршак в. В., Штильман М. И. Полимеры в процессах иммобилизации модификации природных соединений. — М.: Наука, 1984. 261 с.

Handbook of Enzyme Biotechnology Ed by A. Wiseman 2-nd edition — Chichester: John Witey and Sons, 1985, 437 p.

Methods in Ensymotogy//Immobilized Enzymes/Ed by K. Mosbch, — New York: Academic Press, 1976. Vol. 44, 999 p.

Rosevear A. Immobilized biocataly&ts— a critical review//J. Chem. Techno]. Biotechnol. 1984. 34 B. P. 127—150.

Gtazer A. N. The chemical modification of proteins by groupspeciHc and site-specific reagents//In: The Protein. (H. Neurath, R. L. HiU, Eds). — New-York. Academic Press, 1976. VoL 2. P. 1-103.

Дополнител ъ «ал:

Береэин И, fl., Мартинек К. Основы физической химии ферментатив­ного катализа. — М.: Высшая школа, 1977. 280 с.

Курганов Б. И. Алл остер нческие ферменты. — М.: Наука, 1978. 248 с.

Остерман Л. А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. — М.: Наука, 1985. 536 с.

Поверхностные явления и поверхностно-активные вещества/Под ред. А. А. Абрамэона и Е. Д. Щукина. — М.: Химия, 1984. 392 с.

Мартинек К., Березин И, В, Стабилизация ферментов — ключевой фактор при внедрении биокаталнэа в практику //Успехи химии. 1980. Т. 49. С. 737—770.

Можаея В. R. Иммобилизации ферментов как новый подход к решению фундаментальных проблем энзимологни//Успехи биологической химии. 1983. Т. 24. С 99—134.

Хмельницкий Ю. Л., Левашов А. В., Ка&чко И. Л., Мартинек К- Микро­гетерогенная среда для химических (ферментативных) реакций на основе коллоидного раствора ноды в органическом растворителе//Успехи хиадин. L984. Т. 53. С. 54В 5G5.

Мартинек /(-, Левашов А. В., Каячко И. Л„ Хмельницкий Ю, Л., Бере­эин И. В. Мицеллнрнан энэимологня. Бнол. мембраны. Т. 2. 1985. С. 669—696.

Исторический очерк

Ьиокаталнз//Истории моделирования опыта живой при роди /Церезин И. В., Кузнецов В. И, Варфоломеев С. Д. и др. М.: Наука, 1981. 344 с.

153

ПРЕДМЕТНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ

Автолиз 121, 122

Агар 14, 16

Агароза 14

Адсорбция ферментов на но­сителях 46—56; 60, 61; 78 80

• влияние ионной силы 50

• — концентрация фермен­ та 50, 51

модификация носителя

51—54

— фермента 54

пористости носителя 49

рН 50

— — температура 51

удельной поверхности

носителя 49

• способ нанесения в колон­ ке 47, 46

• -— с перемешиванием 47

• — статический 47

• эдектрсюсаждение 48, 60, 61

— электроудерживание 56 Акрил амид 20, 22 Акролеин 130 Акрнлекс 21

Активация носителей, гидрок-сильных и аминогрупп 27— 31, 42, 43

• амидных групп 33

• карбоксильных групп 32_t 33

— путем введения функцио­ нальных групп, альдегидных 17, 30, 33, 34

диазо- 31, 33

— — — — — имндоэфирных 30

154

Активация ферментов ИЗ, 114 Альгинаты 16, 61

Амберлит 19

Амины вторичные, образование с использованием галоген-производных алифатических и ароматических углеводоро­дов 90

• оксиранов 91

• основании Шиффа 92

• соединений с активирован­ ными двойными связями 91

• тииранов 91

Ангидриды кар бон о вы х кислот

Бактериальное заражение ре­акторов

Белковая инженерия 133 Биогель А 14, 15 — Р 21 Бромциан 27. 28, 89

N-винилпирролидон 25, 26, 30,

32, 35

Влажное прядение 70 Вудворда реактив 32, 88 .

Гели для иммобилизации, р ганическне 13, 14, 16, 21, 26, 58-62, 80, 132

• — из готовых полимеров 13_t 14_Т 16 26_¥ 60—62, 132

• — из мономеров 21, 58—59. 80, 132

— неорганические 59- -60 Гепарин 16

Гидрофобные взаимодействия

20, 49 53, 83, 136 Гистерезис 114—116

Дауэкс 19

Двойная иммобилизация 66 Дегидроаланнн 122 Декстран 12—13, 32, 34 Денатурация 99

• необратимая 126, 136

• обратимая 128 Диазоння соли 93 Диссоциация фермента на

субъединицы 125, 128 Диффузионные ограничения

18, 50, 63, 67, 72, 78, 101,

107, 112—115, 117 Диффузия, внешняя 101 —103

— внутренняя 102. 105—107

Им идо карбонаты 27, 28, 89

Имидоэфиры 89. 90

Имнны 91

Иммобилизация сополимериза-ционная 129, 130

Инактивация, «самоубийствен­ная» (суицидная) 124

• ферментов 113, 114

• — при иммобилизации 51₁ 59, 60

Ингнбирование ферментов 113» 114

Карбодиимиды 32, 87 Карбонаты циклические 89 Карбохром 44 Кератин 18

Кинетически контролируем ый процесс 102

Колебания кинетические 114, 116

Коллаген 17, 60

Комплексы полиэлектролитные 61, 62

Конформация иммобилизован­ного фермента 98. 99

Концентрация удельная иммо­билизованного фермента 104

Коферменты 138—141

Лайнунвера-Берка координаты

103, 104

Лантионин 122, 123 Лизиноаланнн 122, 123

Мембраны жидкие 70 Микрокапсулы 68, 69

• белковые 69

• ннтроцеллюлозные 69

• полиамидные 69 Микроорганизмы термофиль­ ные 132

Микросреда иммобилизованно­го фермента 51, 52, 66, 67, 78 Микроэмульсии 73—75, 80

— бездетергентные 75 Мицеллы обращенные 39, 40,

65, 73, 80

Михаэлиса — Ментен уравне­ние 97, 102, 105, 106, 113, 117

Модификация носителя 42, 44, 51—54

— — альбумином 52

— — гидрофобными группами 53

ионами металлов 42, 52

• — лигандами фермента 54

• — липидамн 44, 54

• — полимерами 52

• — танином 53, 54

155

Модификация фермента 54

129 — — аналогом мономера 80,

129 — гидрофобными группами

54

полиэлектролитами 54 Молселект 13 Мочевина, производные 88—

90

Найлон-6, 25. 52

Наночастицы 65

Нернста слой 105

Нитрены 95

Нитрилы 89

Носители алюмосиликатные 43

• белковые 16—18, 30

• кремнеземные 42—43

• полнакрнламидные 20, 30, 32, 33, 99

• полиамидные 25, 27, 30, 31

• полисзхаридные Ю—16, 28, 30, 32, 99, 132

полистирольные 19, 30, 33, 99

• на основе: лип ос ом 37—38, 40-41, 71

• — металлов и нх оксидов 44

монослоев липндов 35— 37

• — поверхностно - активных вещесть 38 40

• — пористой керамики 43

• — поливинилового спирта 26, 30. 31, 62

• — угля и графитнрованной сажи 44

Оксираны 28—29, 91 Определение иммобилизации 7.

45 Орнитиноаланкн 122, 123

Плазмида 133

Плиакриламшшый гель 20— 21, 30, 33, 59, 130, 152

Полимеризация эмульсионная 19, 65, 80

Полиуретаны 2(j

Полнферментные системы 117

Полые волокна 70

Пористость носителей 10, 13, 19, 21. 24

Превращение высоко молеку­лярных субстратов 50, 67, 72

Пришивка 78

Протеолиз 121, 127

Размер частиц носителя 63—

66, 80, 105 Распределение субстрата 100,

101, 105, 108, 112, 118 Рацемизация аминокислот 124 Реакция азосочетания 93

• алкилнроьания 90, 91 арилироьания 90, 9!

• ацилироыакия 85, 86

• конденсации 92

— тиол-дн сульфидно го обме­ на 93

Ретикуляция 79—82 Регенерация НАД(Н) и НАДФ(Н) 141 — 143

— АТФ 143—144

Сайт-специфический мутагенез 133

Связь азометнновая, образова­ние 92

— — восстановление амидная, образование с ис­ пользованием активирован­ ных эфиров 87

— ангидридов 86

— карбодиимндов 87

— — — реактива Вудворда 88

156

• — — хлорангндрндов 86

• дисульфидная, образование 93, 137

Сефадекс 13, 54 Сефароза 14, 31 Силикагелъ 42, 51, 59, 60 Сорбция аффинная 54 Стерические ограничения 108

114 Сополимеризация 20, 21, 24,

26, 80, 130 Сферон 24—25 Сшивка 10, 13, 29, 78, 131

— — второй 105 Фильтровальная бумага 52 Форма носителей 21, 24, 25,