§ 2. Регенерация кофакторов (коферментов}

К категории кофакторов относятся коферменты, простети-ческие группы и ионы металлов. С технологической точки зре­ния наибольший интерес представляет регенерация кофермен­тов. Коферменты — это низкомолекулярные органические соеди­нения, которые играют роль дополнительного субстрата в функ­ционировании многих ферментов. Примеры наиболее распро­страненных коферментов приведены ниже.

Формула Название

Окислительно-восстакоавтельные системы

N H,

он он

он он

(НАЛ)

-р-

(ФМН)

Неокмслнтельн о-в осстнновитеяьные системы

кислот»

S ? (фрагмент молем у ли)

H.C-VJ

Пирнцоксйльфосфаг

I

HO

^Л-СН,—

_X

О

CHJ—CHa—CHi—С—ОН

—гн-,

NH,

₄

UEI OH

CH, or or

—CH—С—CHj—О—P—0—P—

D OH CHj 6 О

_h"h

"О—Р—0—t—О—Р—О-

_J!

ON ОН

АТФ

"О

I

'О "О

-Р—О—Г

_t-

о

например УДФ

140

6н он

CHj—С—NH—СН^С— О СН,—SH

H,N—С

С О

рнтамнн А

При использовании систем иммобилизованных ферментов с коферментами приходится решать две задачи: собственно ре­генерацию кофермента и его удержание в реакционной систе­ме. Последнее обычно осуществляется путем ковалентной иммо­билизации коферментов на полимерных носителях. Для регене­рации разработано несколько подходов, суть которых отражает­ся следующей схемой:

продукт

кофактор

(кофактор)

система регенерации

_У

Согласно этой схеме кофермент, изменяющийся в реакции с участием одного из ферментов, благодаря системе сопряжен­ных реакции регенерирует, т, е. принимает свое первоначальное состояние. В зависимости от типа сопряженной реакции все способы регенерации коферментов можно разделить на две группы: ферментативные и неферментативные. К ферментатив­ным относятся способы регенерации с использованием сопря­женных субстратов или сопряженных ферментов. Нефермента­тивные пути можно подразделить на химические и электро­химические. В качестве примера подробно остановимся на пиридиндинуклеотидных коферментах НАД(Н) и НАДФ(Н), способы регенерации которых разработаны наиболее полно.

Ферментативные способы регенерации НАД(Н) и НАДФ(Н), Использование сопряженных субстратов.

Регенерация коферментов может быть проведена, если в систему ввести избыточное количество сопряженного субстрата того же фермента, катализирующего реакцию в обратном на­правлении. Схематически принцип метода выглядит следующим образом:

кофактор (окисленный или

побочный продукт

основном продукт

кофактор ( восстанови енный

ИЛИ 0КИСЛСШ1ЫЙ)

сопряженный субстрат

141

Системы регенерации НАД на основе алкогольдегидроге-назы из печени лошади впервые были предложены Дж. Ван Ей-сом. Один из применяемых процессов — это процесс восстанов­ления л акт альдегида в пропан-1,2-диол:

Н⁺ + СН₃СН(ОН)СНО + НАДН «± СН_эСН(ОН)СН;гОН + НАД⁺

В присутствии сопряженного субстрата» этанола, число циклов НАД может достигать 800.

Разработаны также методы регенерации, основанные на дру­гих парах сопряженных субстратов» в частности циклогекса-под и я-нитрозо-М.Ы'-днметиланилин. Преимущество использо­вания этой пары заключается в возможности непрерывного слежения за реакцией восстановления п- нитрозо-N, N'-дн мети л -анилина.

Недостатки использования сопряженных субстратов в процес­сах регенерации НАД связаны с тем, что, во-первых, равновесие реакции альдегид *~ спирт сильно сдвинуто в сторону спирта (что Ype6yeT высоких концентраций сопряженного субстрата) и, во-вторых, выделение основного продукта из смеси затрудне­но. Применение известных методов иммобилизации ферментов и коферментов будет способствовать преодолению возникшей проблемы.

Использование сопряженных ферментативных реакций. Суть этого способа регенерации заключается в том, что в реакцию, катализируемую ферментом А, дополнительно вводится фер­мент Б, в функционировании которого участвует сопряженная форма кофермента:

фрмцтЛ

основной субстрат j— - -^—*- основной продукт

/ \

кофактор / \ кофактор

(восстановленный [ ] (окнсюилый или

или окисленный) \ / )