§ 3. Влияние иммобилизации на инактивацию ферментов

Для иммобилизованных ферментов число возможных инакти-вационных механизмов существенно меньше, чем в случае раст­воримых ферментов.

Иммобилизация подавляет такие поли молекулярные инакти-вационные процессы, как агрегация и автолиз. Дело в том, что в иммобилизованном состоянии подвижность белков, как прави­ло, резко ограничена, в то время как существенной стадией обоих механизмов является перемещение двух (или нескольких) молекул ферментов друг к другу с их последующим взаимодей­ствием. По этой же причине для многих форм иммобилизован-ных белков исключен механизм инактивации путем сорбции на стенках реакционного сосуда и часто удается существенно за­тормозить необратимую диссоциацию олнгомерных белков на субъединицы.

Иммобилизация на (или в) носителе, как правило» создает

(26

вокруг молекул фермента стерические ограничения, т. е- как бы экранирует их от внешнего раствора. Это приводит к сущест­венному ограничению диффузии молекул других_т не связанных с носителем ферментов, в частности протеаэ, фосфорилаз, фос­фата з. Поэтому для иммобилизованных ферментов практически сведены на нет такие инактивационные процессы, как протеолиз_т микробное заражение и фосфоршшрование.

Иммобилизованные белки стабильнее нативных по отношению к инактивации в потоке. Причина заключается в том, что носи­тель механически защищает молекулы ферментов от деформа­ции в потоке, выполняя роль своеобразного демпфера.

В последние годы активно развиваются методы иммобили­зации, позволяющие ковалентно пришивать молекулу кофактора в районе активного центра фермента или совместно иммобилизо­вать молекулы кофактора н фермента на одном носителе в не­посредственной близости друг от друга. С помощью таких ме­тодических приемов становится возможным подавить таком ннак-тивационный механизм, как десорбция кофактора из активного центра фермента.

Наиболее сложная задача — затормозить химические изме­нения в белке, приводящие к инактивации. Однако и в этой области имеются положительные примеры использования иммо­билизации.

В тех случаях, когда инактивация происходит под действием пероксида водорода или супероксидных радикалов, хорошо за-рекомендовал себя следующий прием. Подвергающийся инактива­ции белок иммобилизуют совместно с каталазой или супероксид-дисмутазой — ферментами, катализирующими разложение, соответственно, НэОа и OjT

Как уже говорилось, некоторые ферменты инактивируются вследствие окисления кислородом воздуха высокореакштнно-способных функциональных групп их активного центра и в пер­вую очередь SH-групп. Такую инактивацию также удается подавить методами иммобилизации. Для этого фермент иммоби­лизуют в полиэлектролитной матрице, обладающей способностью «высаливать» кислород. В результате фермент экранирован от контакта с инактиватором и стабильность его по отношению к окислению становится существенно выше, чем у неиммоби-лизованного,

Кроме того, можно создать условия для конкуренции за вещество-инактиватор. Например* многие ферменты, имеющие SH-группы, необходимые для катализа, ннактивируются в ре­зультате их «отравления» катионами тяжелых металлов по ме­ханизму образования меркаптидов. Иммобилизуя такой фермент с другим белком с высоким содержанием реакцией неспособных SH-групп или пришивая к матрице носителя низкомолекулярные тнолы, добиваются того, что основная часть катионов металлов расходуется не на «отравление» фермента, а на модификацию SH-rpynn «несущественного» белка или тиола.

127