§ 1. Основные принципы конструирования препаратов ковалентно иммобилизованных ферментов

Для целей иммобилизации существует буквально неогра­ниченный набор различных материалов: неорганических (стекла, керамика, оксиды металлов и т. д.), природных полимеров (целлюлоза, хитин, агароза_т крахмал и другие полисахариды) и, конечно, синтетических полимеров и сополимеров (см. гл. \). Одни из этих веществ могут быть использованы непосредственно в качестве носителей, другие предварительно должны быть под-

77

вергнуты специальной химической обработке активаторалш или модифицирующими агентами. Иными словами, ««химическая методология» иммобилизации не испытывает недостатка ни в вы­боре исходных материалов, ни в способах их трансформации. Однако вое это составляет предмет и задачи тактики. Что же касается стратегической линии, то она базируется на принципах конструкции конечного препарата, а таких принципов всего три. Дело в том, что независимо от числ$ и химической природы компонентов» вовлеченных в процесс иммобилизации, числа и сложности отдельных стадий этого процесса, принци­пиально различающихся элементов-блоков химических конструк­ций не более трех; собственно молекула фермента (Ф), но­ситель (Н) и сшивающий би- или полифункциональный реа­гент (С), называемый также «сшивка», «вставка*, «ножка», «спейсер» ит.п,

< Таким образом, ковалентная иммобилизация ферментов под­разумевает создание конструкций из связанных химическими связями трех элементов: Н—С — Ф (как максимум) и (или) двух, Н — Ф и С — Ф {как минимум). В свою очередь прин­ципы конструирования соответствующих конъюгатов можно на* глядно обозначить терминами «пришивка» (для Н — Ф), «сшив­ка» {для Н — С — Ф) и «вшивка» {для С — Ф).

Рассмотрим эти принципы более подробно. При наличии на поверхности носителя функциональных групп» способных всту­пать в химические реакции с функциональными группами фер­мента с образованием ковалентных связей: получение иммобили-зованного фермента сводится к исключительно простой про­цедуре, аналогичной используемой для физической адсорбции фермента на носителе. Методических различий здесь действи­тельно нет: в раствор фермента вводится носитель и фермент на нем адсорбируется, однако адсорбция при химической иммобилизации необратимая — фермент пришивается к носителю одной или несколькими ковалентными связями (рис. 11, а). Тесный контакт белка с носителем может оказаться нежелатель­ным, например, из-за неблагоприятно го изменения микросреды фермента, стерических и диффузионных ограничений. Выходом из такой ситуации становится отдаление молекулы иммобнлизо ванного фермента от поверхности носителя на некоторое рас­стояние. Для этой цели применяются сшивающие реагенты раз­личной длины. Они могут быть как простыми бифункциональ­ными (т. е. с двумя одинаковыми или различными по химиче­ской природе реакционноспособными группировками), так и весь­ма сложными полифункциональными реагентами, в том числе построенными из отличающихся по химической природе звеньев с различными по прочности связями между ними. Тем не менее здесь используется один общий принцип ковал^нтной иммобили­зации — сшивка фермента с носителем посредством сшивающего агента (рис. 11,6).

По разнообразию методических приемов, по крайней мере

7В

Рис. II, Блок-схемы ковалентной иммобилизации фер­ментов

за счет сшивающегося агента, этот способ несравнимо богаче и гибче предыдущего. Во-первых, подбором длины сшивающего агента (или подбором оптимальной смеси сшивающих агентов различной длины) можно изменять каталитические характе­ристики иммобилизованного фермента. Во-вторых, можно спе­циально конструировать сшивку так, чтобы она содержала связь, лабильную в определенных условиях или специфически расщепляемую определенными реагентами (в частности, фер-ментативно). Это дает ключ к контролируемому отделению им­мобилизованного фермента от носителя, например, при решении проблем направленного транспорта ферментов в живом ор­ганизме.

Целый ряд разнообразных решений задачи ковалентной им­мобилизации ферментов дает использование систем, изначаль­но не содержащих носителя, а только фермент и сшивающие агенты, где носитель {как твердое тело) формируется непосред­ственно в процессе иммобилизации или же сам фермент служит одновременно и носителем. Речь, таким образом, пойдет здесь о ковалентном вшивании молекулы фермента в различные типы сеток (рис. II, в). Идея конструирования ферментных сеток (ретикуляция ферментов) вытекает из «олифу нкиионалышй при­роды самой молекулы фермента, имеющей на поверхности по-

79

мимо активного центра достаточно большое количество реак-ционнеспособных групп. При введении в раствор фермента би­функционального сшивающего агента отдельные молекулы фер­мента сшиваются друг с другом и образуют более или менее сложные агрегаты сетчатой структуры, е которой узлами служат сами молекулы фермента. В зависимости от природы и количе­ства сшивающего агента можно получить как водорастворимые, так и водонерастворимые препараты.

Другой прием ретикуляции основан на использовании фер­ментов, предварительно ковалентно модифицированных реаген­том, содержащим двойную связь, например акрилоштхлоридом, В этом случае при сополимернзации белкового макромономера с низкомолекулярными мономерами (например, с акрил амидом) образуются сетчатые полимерные гели, сшитые белком или дополнительным сшивающим мономером (например, N_T N-мети-лен-бис-акриламидом). В рассматриваемой системе исходное состояние — жидкий раствор, а конечное (после полимериза­ции) — твердое тело (гель), причем, естественно» оно приобре­тает форму того сосуда (реактора), в котором проводится поли­меризация. Целенаправленное использование этого явления положено в основу целого ряда оригинальных способов им­мобилизации. Сшивкой белка в объеме растворителя (сополи-меризацией) получают трехмерный гель (рис. 12, а) в виде крупного однородного блока, который можно механически измельчать и использовать в виде более или менее мелких частиц в суспензиях. Трехмерный гель можно готовить и непосредст­венно в виде мелких частиц сферической формы путем эмульси­онной полимеризации. Эмульсии получают диспергированием водного раствора, содержащего мономеры, в несмешивающемся с водой органическом растворителе. Предельный вариант таких систем — микроэмульсии, или гндратированные обращенные ми­целлы поверхностно-активных веществ (ПАВ) в органических растворителях. В мицеллярыых системах размеры «капелек», со­держащих модифицированный фермент и мономеры, можно варьировать и даже получать их близкими к собственным разме­рам молекул ферментов. Это новое качество иммобилизации — молекулярный уровень. Иными словами, при использовании систем обращенных мицелл ПАВ в органических растворителях, можно обшивать отдельные молекулы фермента полимерной оболочкой заданной толщины, т. е. в полном смысле одеть фер­мент в «рубашку, сшитую по мерке» (рис. 12,6).

Процесс ретикуляции может быть реализован не только в растворе фермента, но и при использовании его иммобилизован­ных препаратов. Так, в случае фермента, предварительно иммо­билизованного на химически инертном носителе путем физиче­ской адсорбции, дополнительная обработка сшивающим агентом приведет к повышению прочности (задубливанню) препарата. Носитель здесь непосредственно не принимает участия в хими­ческой реакции — он служит лишь матрицей для организации

80

Рис, 12. Типы ретмкуляции ферментов:

а - межмолекулярная трехмерная (етка; б — сетчатая оболочка вокруг молекулы фермента (молекулярна иммобилизованный фермент); в- дв>мернзм сетка; г — внутримолекулярная сетка из полипептидных цепей белка и химических «скобок»

слоя (монослоя) адсорбированного фермента и обусловливает двумерную направленность ретикуляции. Более того, носитель может быть вообще удален (например, нитроцеллюлозу раство­ряют в метаноле) и, таким образом, получится сшитая фермент­ная пленка (рис. 12, з).

В принципе можно представить себе «нульмерную» ретикуля-

дню, поскольку являющаяся узлом ферментной сетки молекула фермента — это не условная точка, а довольно-таки крупный объект. Иными словами, от сеток межмолекулярых перейдем к внутримолекулярным, составленным нз полимерных цепей бел­ка и химических сшивок. Один из примеров такого рода был уже рассмотрен (рис. 12,6). Добавим, что препараты молеку-лярно иммобилизованных ферментов могут быть получены, если обе группы бнфункионального сшивающего реагента проезаимо-действуют с одной и той же молекулой белка. В таком случае (рис. 12, г) речь идет о наложении «химических скобок», внутри-молекулярно закрепляющих структуру фермента. Практическая реализация этого подхода в гомогенном растворе затруднена из-за образования наряду с внутримолекулярными межмолеку­лярных сшивок. Исключить меж молекулярные взаимодействия можно путем перехода от гомогенных к микрогетерогениым сис­темам с пространственно изолированными молекулами фермента, например солюбилнэациеи ферментов в органических растворите­лях с помощью гндратированных обращенных мицелл ПАВ.