§ 1. Природные носители

Большое значение природных полимеров в качестве носите лей для иммобилизации объясняется их доступностью и нали­чием реакционно-способных функциональных групп (в исходном или модифицированном препарате), легко вступающих в раз­личные химические реакции, а также высокой гидрофильностыо. К недостаткам природных носителей можно отнести неустойчи­вость к воздействию микроорганизмов и относительно высокую стоимость многих из них.

Полисахариды. Наиболее часто для иммобилизации исполь­зуют целлюлозу, декстран, а га розу и их производные.

Целлюлоза представляет собой поли-],4-Р-£>-глюкопиранозил-£>-глкжопиранозу

Целлюлоза отличается высокой степенью гидрофильности, а наличие большого числа гндроксильных групп дает возможность ее легко модифицировать путем введения различных заместите­лей. Препараты целлюлозы для придания им химической устой­чивости «сшивают» эпихлоргидрнном. Для увеличения механиче­ской прочности целлюлозу гранулируют путем частичного гидро­лиза, в результате которого разрушаются ее аморфные участки. На их место для сохранения пористости между кристаллическими участками вводят химические сшивки. Гранулированная целлю­лоза благодаря простоте получения, сравнительно низкой стои­мости относится к удобным носителям для иммобилизации ферментов и аффинной хроматографии.

Гранулированную целлюлозу довольно легко превращают в

ю

Таблица L Целлюлоза и некоторые ее производные

Заместитель по ОН-групие

Название препарата

Фирма

ОРОаН

ОСНаСООН O(CH_a)_aNH*

Целлюлоза

Аминоэтялцеллюлоза

Фосформл целлюлоза (Р-10)

Целлюлоза

Диэтиламиноэтнлцел-поза

Карбокснметнлцеллю-за

А м нноэтил цел л юл оэа

п -Амин обензон л целлю­лоза

«Whatman» (Англня)

То же

«Sigma» (США)

*Bk)-Rad-Labs>

(США)

ОСОСН,Вг

O(CH₂>aN(C_aH₅h

OCH^CONHNHs ОСОСНгВг

Бром аиетн л целл юлоэа

Бенэонлдиэтнламнно

этнлцеллюлозз

Г ндразидка рбокснметнл -

целлюлоза

Ьромя цетил целл юлояа

* ~ Ам ннобензилоксн ме­тил цел л юлоэа

«Serva» (ФРГ) «Reanal» {ВНР)

То же

«Miles Labs» (Англня)

То же То же

I NHs

O(CH₅)₂N(C*H₆)_a

OCHjCOOH

NH?

осн.

O(CH_a)_aSO₃H O(CH_ahfi(C_aH_sb

Д Э АЭ - пел л юл оз а

КМ- целл юлоза

п-А мн н обензнл целлюлоза

С ул ьфоэтнл целл юл оза

Триэтил аммоннйэтнл-

цел.пю;киа

НПО «Биохим-реактнв»

То же

различные ионообменные производные, В табл. I приведены основные промышленные марки целлюлозы, выпускаемые различ­ными фирмами.

Недостатком целлюлозы как носителя можно считать ее не­устойчивость к воздействию сильных кислот, щелочей н окнсли-телей.

Хитин-—природный аминополнсахарид. Его можно рассмат­ривать как целлюлозу, в которой СН^ОН-группа заменена ацет-амндным остатком:

И

СН₂ОП

сн, он

JO

(в хитине R=

в хитозане R =—Н)

Хитин — основной компонент наружного скелета ракообраз­ных, насекомых, а также клеточных оболочек некоторых грибов. Это соединение является отходом промышленной переработки креветок и крабов, поэтому доступно в больших количествах при относительно низкой стоимости.

Хитин обладает пористой структурой, не растворяется в воде, разбавленных кислотах и щелочах, а также в органических растворителях. Для переведения в реакционноспособную форму он может быть модифицирован глутароиым альдегидом, а также солями тяжелых металлов [например, Ti(IV)].

Обработка хитина концентрированными растворами щелочей (деацилирование) приводит к образованию хитозана. Хитозан, имеющий свободные аминогруппы, может использоваться для ковалентной иммобилизации ферментов с помощью таких би­функциональных реагентов, как диа льде гиды, диизоцианаты (см, гл. ill). В отличие от хитина хитоэан растворяется в минераль­ных и органических кислотах, поэтому для иммобилизации он часто применяется в виде растворов (рН 3—7).

Употребление хитоэана в качестве носителя дает хорошие результаты, так как полученные препараты иммобилизованных ферментов обладают высокой каталитической активностью и ус­тойчивостью к микробному воздействию; наблюдается также су­щественное повышение термостабильности белков» иммобилизо­ванных на хитозат'.

Декстран — поли-1,6-а-/)-глюкопиранозил-0-гл1ОКопирано-за — разветвленный полисахарид из бактериальных источников, содержащий остатки глюкозы, связанные, в основном, 1,6-глюко-знднымн связями (а также, 1,2-, 1,3- и 1,4-связями):

12

Гели на основе декстрана, сшитые эпихлоргидрнном» вы­пускаются фирмой «Pharmacia» (Швеция) под названием «сефа-декс» и «Reanab (ВНР) под названием кмолселект». При вы­сушивании сефадексы легко сжимаются, а в водных растворах сильно набухают. Эти качества выражены тем сильнее, чем меньше процентное содержание сшивки. Изменением доли сшив­ки регулируется средний размер пор, образуемых пространст­венной сеткой геля.

Следует отметить, что продажные препараты сефадексов со­держат небольшое количество карбоксильных групп, что придает им некоторое сродство к катионам Этот факт необходимо учи­тывать при иммобилизации металлозависимых ферментов.

Обращают на себя внимание такие свойства гелей на основе декстрана, как высокая химическая стойкость и гидрофиль-ность (из-за наличия большого количества гидроксильных групп), Сефадексы G-типов различаются по степени сшитости и, следовательно, по степени набухания и по пористости. Сущест­вуют разновидности модифицированных сефадексов для исполь­зования в органических растворителях (LH-20 н LH-60).

Фирмы «Pharmacia» и «Reanab выпускают также ряд произ­водных декстрана, содержащих различные функциональные груп­пы (табл. 2),

К группе декстранов можно отнести крахмал, являющийся смесью полисахаридов, основным компонентом которой является амилоза — поли-1,4-а-£)-глюкопиранозил-£) -глюкопираноза и амилопектин — разветвленный полисахарид, состоящий из остат­ков £>-глюкозы, связанной 1_т4-а-глюкозидными связями, а в мес­тах разветвлений — 1,6-оглюкозидными связями.

Химической модификацией крахмала сшивающими агентами, такими, как формальдегид, глиоксаль, глутаровый альдегид» по­лучен новый носитель — губчатый крахмал, обладающий повы­шенной устойчивостью по отношению к ферментам, гидролизую-

Таблица 2. Коммерческие препараты производных декстрана

Функциональная группа

Название и марка

Фирма

ОСНгСООН

OCH₂CH*N ( —СН(ОН)СН_Э

OCHsCOOH

Карбо кс и мети л сефа деке (СМ)

Сульфоп ропнлесфадекс <SP)

Д иэтил а м н ноэти л сефа -деке IDEAE)

Днэтщ] (2-окси пропил) амнноэтнлсефадекс (QAE)

Молселект (СМ)

Молседект (SE)

Молсе-лект (DEAE)

«Pharmacia» (Швеции)

«Reanal» (ВНР)

щим полисахариды. Введение днэтаиол- и триэтаноламиннык групп дает возможность применять губчатый крахмал для им­мобилизации различных ферментов.

На основе декстранов могут быть получены водораствори­мые препараты с различными функциональными группами, при­меняемые в медицине как носители лекарственных веществ. Вы­бор носителей иа основе декстрана для медицинских целей обус­ловлен, в частности» тем, что они легко подвергаются биодегра-дзции.

Агароза ■— поли-{5-галактопиранозил*3,6-ангидро-а-/^галакто*-пираноза:

Она широко используется как носитель для иммобилизации. Однако стоимость агарозы довольна высока, поэтому разраба­тываются различные методы ее модификации с целью получения легко регенерируемых форм. При охлаждении горячего 2—6%-ного водного раствора агарозы до температуры ниже 45°С образуются прочные крупнопористые гели, представляющие со­бой сложную смесь из заряженных и нейтральных полисахари­дов. В процессе образования геля индивидуальные полисаха-ридные цепи образуют двойные спирали, которые далее агре­гируют с образованием «узлов*. При температуре около Ю0°С гель агарозы плавится, поэтому в отличие от сефадексов его нельзя автоклавировать. Высушивание агарозы приводит к необ­ратимой деструкции геля, поэтому его необходимо кранкть в виде водной суспензии.

Гели на основе агарозы производятся фирмами «Pharmacia* (Швеция) и «Bio-Rad Labs» (США) и выпускаются под назва­ниям к «сефароза» и «биогель А» соответственно (табл. 3), а также «LKB» (Швеция) и «IBF* (Франция) — под названием «ультрогель А». При производстве сефарозы агароза подверга­ется специальной обработке, в частности, из нее удаляются заряженные полисахариды- Различают 3 типа сефароды и 6 ти­пов биогеля А в зависимости от концентрации агарозы (табл. 3).

Дли придания большей химической и термической стабиль­ности препараты сефарозы обрабатывают 2,3-дибромпропанолом в сильно щелочных условиях, В результате такой обработки по­лучается поперечное шитый гель агарозы — сефароза CL (препа­рат фирмы «Pharmacia»),

Агар выделяют из клеточных мембран некоторых красных морских водорослей. Точный состав ею не известен Однако установлено, что он содержит» по крайней мере, два полисаха-

U

Таблица 3. Агароэа и некоторые ее производные

рнда: а га розу и агаропектин, Г ел к агара образуются аналогично агарозным при охлаждении горячего водного раствора до темпе­ратуры 38^СС. После высушивания гель агара превращается в прозрачную пленку, что позволяет использовать для изучения иммобилизованного в геле фермента оптические методы иссле­дования. К преимуществам агара следует отнести его низкую стоимость и нетоксичность. Отличительной особенностью этого носителя является способность формировать механически проч­ные гели даже при малых концентрациях в растворе.

Существенного улучшения свойств агара можно достичь сши­ванием эпихлоргидрином, диэпоксидными соединениями и т. д. Сшитый агар с регулируемой проницаемостью устойчив к на­греванию даже в щелочной среде, обладает высокой механиче­ской прочностью, а наличие большого количества оксигрупп поз­воляет легко модифицировать носитель. Это дало основания Дж. Порату (1976) считать агар почти идеальным носителем.

Альгиновые кислоты и их соли — это полисахариды бурых морских водорослей, состоящие из связанных р-1,4-связями остатков £>-маннуроноБОЙ кислоты:

сода

сош

п

Характерным свойством этих носителей является резкая за­висимость их растворимости от температуры и рН раствора. Так, альгиновые кислоты хорошо растворимы в горячей воде и плохо — в холодной. Алыинаты кальция обладают способ­ностью образовывать гели, поэтому они используются для иммо­билизации ферментов, клеток и органелл путем включения.

Гепарин представляет собой кислый полисахарид, содержа­щий чередующиеся звенья сульфатированной D-глюкуроноеой кислоты (или L-идуроновой) и сульфатиро ванного глюкоза мина (или N -ацетил -глюкоз амина):

Белки. Использование белков в качестве носителей для нм-

16

мобилизации ферментов представляет интерес как для фунда­ментальных биохимических исследований, так и для практиче­ских целей» в частности для медицины. Этот интерес обусловлен тем, что многие ферменты в клетке функционируют в тесном контакте с другими ее компонентами, & частности с липидами и белками. Поэтому полагают, что изучение поведения фермен­тов, иммобилизованных на белковых матрицах, позволит понять закономерности функционирования ферментов in vivo. С точки зрения практической значимости важными свойствами этих но­сителей являются высокая вместимость по отношению к фер­ментам и способность к биодеградации, а также возможность применения большинства из них (благодаря фибриллярной при­роде) в виде тонкой толщиной 80 мкм пленки (мембраны). Иммобилизацию на белковых носителях можно проводить как в отсутствие, так и в присутствии сшивающих агентов.

К недостаткам белков как носителей медицинских препаратов для использования in vivo следует отнести высокую иммуно-генность (исключение составляют коллаген и фибрин).

Наиболее часто в качестве носителей применяются структур-ные белки, такие, как кератин, фиброин, коллаген; двигательные белки, в частности миозин, а также транспортные белки» напри­мер сывороточный альбумин.

Коллаген — фибриллярный белок группы склеропротеидов, основной компонент хрящей и сухожилии, обладаем высокой прочностью на разрыв. Особенностью этого белка является его высокая гидрофильность. Так, коллаген способен сорбировать от 1 до 5 г воды на 1 г белка, оставаясь в нерастворенном виде и сохраняя волокнистую структуру.

Коллаген — самый распространенный белок высших живот­ных. Легкость выделения коллагена из ряда биологических источников в сочетании со свойственным белкам наличием боль­шого числа групп — участков для связывания ферментов — при­влекает внимание к коллагену как к носителю для иммобилиза­ции ферментов. Коллаген используют и в виде модифици­рованных производных, придавая матрице широкий набор же­лаемых свойств. Так, блокированием амино- или карбоксильных групп можно изменить поверхностный заряд носителя и, соответ­ственно, гидрофильно — гидрофобный баланс; с помощью сшива­ющих агентов можно получить сжатую микроструктуру. Наибо­лее часто коллаген употребляется в азид ной форме. Для этого

карбоксильные группы коллагена®* этерифицируют с последу­ющей обработкой гидразином и азотистой кислотой:

@—CONHNHj

Продуктом переработки коллагена является желатина. Спо­соб ее получения весьма прост-— коллаген длительно обрабаты-

и аллее символом (и) обозначается носитапь

17

вается кипящей водой, в ходе чего гидролизуются некоторые ковалентные связи коллагена, В результате волокнистый, нераст­воримый коллаген превращается в растворимую смесь полинеп-тидов, называемую желатиной. Ценность этого носителя, облада­ющего гелевой структурой, заключается в его нетоксичности, легкости биодеградации, что позволяет применять желатину в фармацевтической и пищевой промышленностих.

Другим весьма распространенным фибриллярным белком группы склеропротеидов является кератин. Из кератина почти полностью состоят шерсть, волосы, роевые покровы, шелк и т. д. Как правило, кератин получают при переработке перьев (побоч­ный продукт .птицеперерабатывающих фабрик). Таким образом, кератин дешев и доступен в больших количествах, что немало­важно при использовании белков в качестве носителей.

Существуют две формы кератина — аир. Важной особен­ностью а-кератина является высокое содержанке цистеина, что представляет особый интерес для иммобилизации ферментов, со­держащих свободные SH-группы. р-Кератины, в частности фиб­роин (белок шелка и паутины), не содержат остатков цистеина, но в них очень высокое содержание глицина н аланнна, что необ­ходимо для образования вытянутой зигзагообразной конформа-ции полипептидной цепи. Для 0-конформации характерны меж­цепочечные водородные связи, в образовании которых участвуют все пептидные группы ji-кератина, что придает значительную устойчивость ^-структуре- Молекулярные отличия влияют на механические свойства. Так, нити fj-кератина обладают мяг­костью, гибкостью и нерастворимостью, однако уступают по прочности а-кератину. Выбор той или иной формы кератина для иммобилизации определяется конкретной задачей, стоящей перед исследователем .

При иммобилизации ферментов на носителях белковой при­роды нельзя не считаться с появлением диффузионных ограни­чений, определяемых гелевой структурой матрицы. Интересное решение проблемы диффузионных ограничений было найдено в случае использования в качестве носителей бел ков-глобул и но в хлопчатника. Так как комплекс фермент-носитель способен на­ходиться как в растворимой, так и в нерастворимой форме в зависимости от ионной силы раствора, то, изменяя последнюю, можно переводить комплекс в растворимую форму и облегчать, например, переработку нерастворимых в воде субстратов. Здесь укажем также, что подобным свойством обладают и некоторые синтетические полимеры, в частности полиэлектролиты и их комплексы, находящие все более широкое применение для иммо­билизации (ферментов.