§ 7. Иммобилизация ферментов в гелях, полученных полимеризацией мономеров

Органические гели. Суть методики. Для проведения иммо­билизации готовят реакционную смесь* главными компонентами которой являются фермент, мономер, сшивающий агент (если это необходимо) и водный буферный раствор. Иногда в смесь для полимеризации вводят также добавки, предохраняющие фермент от инактивации при гелеобразовании. Для получения геля готовую смесь подвергают воздействию какого-либо факто­ра, инициирующего процесс полимеризации мономеря.

Полимеризация. При проведении полимеризации обычно ис­пользуемые концентрации мономера н сшивки составляют, соот­ветственно, 30—60% и приблизительно 5% от общей массы реакционной смеси. Полимеризация протекает по радикальному механизму. Источниками радикалов, являющихся инициаторами процесса полимеризации, могут служить некоторые окислитель-но-восстановительные и фотохимические реакции, в коде кото­рых в качестве промежуточного продукта образуются свободные радикалы. Наиболее широко применяется окислительно-восста­новительная пара персульфат калия (или аммония) — N^N'.N'-тетра метил этнлендиа мин. Инициирование полимеризации дости­гается при внесении этих веществ в раствор мономера. В ка­честве фотохимического инициатора обычно используется рибо­флавин; в этом случае полимеризация происходит при облучении реакционной смеси мощным источником света. Свободные радикалы, необходимые для начала полимеризации, могут гене­рироваться также при воздействии на раствор мономера у-нз-лучения или потока электронов. Преимущество этого способа состоит в том, что он не требует введения инициаторов в исход­ную смесь.

* В принципе, иммобилизацию иуп'М включения в гель можно осуществить также, пропитывай ;уже готовый гель pavnjnpmi фермента. Этот способ, о.гнако, не имеет широкого практического применения, поскольку получаемые с его по­мощью препараты иммобилизованных фермснюв характерен у ются ничьим удель^ ной активностью, а сам процесс им.моСниичашш занимает длительное время на зв HUJKort скорости диффузии фермой г<я в порах геля. Одно Из немногих исключений составляет списанияя ниже иммобилизация на колл яге новых мембранах путем их и микширования водным растворим фермента.

58

При проведении иммобилизации могут возникать затрудне­ния, обусловленные некоторыми особенностями протекания реак­ции полимеризации. Так, например, полимеризация ингибируется присутствующим в растворе молекулярным кислородом, и во многих случаях для его удалении рабочий раствор предвари­тельно насыщают инертным газом — азотом или аргоном. Кроме того, в ходе полимеризации выделяется значительное количество теплоты, что приводит к повышению температуры внутри обра­зующегося полимерного блока до 75°С. Такое сильное нагрева­ние вызывает инактивацию ферментов, поэтому гтолимериэую-щнйся раствор необходимо охлаждать так, чтобы его темпера­тура не превышала 20—25°С.

Осложнений, связанных с ингибирующим действием кисло­рода и нагреванием, можно избежать, если проводить полиме­ризацию путем у-облучения замороженного и охлажденного до —80°С рабочего раствора. -

После окончания полимеризации, которая в зависимости от условий (природа мономеров, количество инициатора, темпера­тура и т. п.) может продолжаться от нескольких минут до не­скольких часов, образуется блок полимерного геля, содержащий иммобилизованный фермент. Следует учитывать, что в геле мо­гут оставаться примеси неизрасходованных при полимеризации мономеров н инициаторов. Чтобы избавиться от них, гель обычно механически измельчают и тщательно промывают буферным раствором. При необходимости длительного хранения измельчен­ные частицы подвергают лиофильной сушке.

Инактивация фермента при полимеризации. В процессе об­разования полимерного геля фермент подвергается различным денатурирующим воздействиям, в результате чего может проис­ходить его инактивация, вплоть до полной потери каталитиче­ской активности. Помимо уже упоминавшегося возможного разо­грева при полимеризации денатурацию фермента могут вызывать компоненты реакционной смеси, в первую очередь мономер. На­пример, акриламид по своему денатурирующему воздействию на ферменты близок к мочевине. С другой стороны, солиакрнл-амид этим свойством не обладает- Именно поэтому обязательной стадией иммобилизации является тщательная промывка поли­мерного геля от оставшихся примесей мономера и инициатора.

Инактивация фермента может происходить под действием свободных радикалов, образующихся при радикальной полиме­ризации. Для защиты фермента от неблагоприятных воздействий в реакционную смесь иногда вводят стабилизирующие до­бавки. В роли таких добавок могут выступать, например, инерт­ные белки (обычно альбумин) или вещества, являющиеся суб­стратами или продуктами реакции, катализируемой данным фер­ментом.

Неорганические гели. Для иммобилизации ферментов может быть использован гель поликремниевой кислоты (силякагель), который представляет собой продукт поли конденсации монокрем-

нневой кислоты Si (ОН) 4- Методика иммобилизации состоит в том, что в золь кремниевой кислоты (полученный, например, путем гидролиза кремнийорганического соединения) добавляют раствор фермента. Через несколько часов в результате само­произвольной полимеризации образуется гель, представляющий собой трехмерную сетку из атомов кремния, соединенных кисло­родными мостиками. Полученный гель высушивают, измельчают и отмывают от невключившегосн фермента.

Иногда для иммобилизации ферментов применяют гель фос­фата кальция. В этом случае образование пространственной сетки обусловлено не ковалентными, а ионными связями.