§ 9. Влияние различных факторов

на каталитическую активность ферментов, иммобилизованных

путем включения в гель

Содержание фермента в геле. Каталитическая активность им­мобилизованного препарата возрастает с увеличением количества включенного фермента. Такого увеличения можно добиться, оче­видно, повышая концентрацию фермента а исходной смеси, ис­пользуемой дли приготовления геля. Следует, однако, иметь в виду, что растворимость белков в гелеобразующих системах может быть существенно ниже растворимости в водном буферном раст­воре.

62

Другой важный фактор, определяющий содержание фермента в геле,, — это структура самого геля, точнее^ размер имеющихся в нем пор. Чем меньше диаметр пор, тем более эффективно фер­мент удерживается в матрице геля, а значит, тем выше будет каталитическая активность иммобилизованного препарата. Порис­тость геля можно регулировать, изменяя состав исходной смеси для его получения. Например, плотность гелей, получаемых поли­меризацией производных акриловой кислоты, возрастает с увели­чением исходной концентрации мономера. (Следует помнить, од­нако, что слишком высокая концентрация мономера может вызы­вать денатурацию фермента, поэтому зависимость удельной ка­талитической активности иммобилизованного препарата от исход­ной концентрации мономера часто проходит через максимум, который обычно лежит в интервале концентраций мономера 30—60%.) Размер пор сильно зависит также от концентрации добавляемого в раствор мономера сшивающего агента, В случае акриловых полимеров эта зависимость имеет вид кривой с миниму­мом при концентрации сшивки около 5%. При этой же концентра­ции сшивки достигается максимальная активность включенного фермента.

Эффективность включения повышается не только при умень­шении диаметра пор геля, но и при увеличении размеров фермент­ной глобулы. Поэтому для предотвращения вымывания из геля ферменты с небольшой молекулярной массой иногда перед прове­дением иммобилизации подвергают обработке глутаровым альде­гидом, в результате которой получаются крупные ковалентно сшитые белковые агрегаты, прочно удерживаемые полимерной матрицей.

размеры геле вы х частиц. Увеличение концентрации фермента в геле* не всегда приводит к соответствующему повышению ката­литической активности иммобилизованного препарата. Дело в том, что при высокой концентрации фермента весь субстрат перера­батывается уже в поверхностном слое геле вой частицы, не дости­гая молекул фермента, расположенных в ее глубине. В результате каталитический потенциал системы используется не полностью и общая наблюдаемая удельная активность фермента снижается. (Более подробное обсуждение этого вопроса см, в гл. IV.) Оче­видно, что влияние этого неблагоприятного эффекта можно осла­бить, если использовать мелкоизмельченный препарат иммоби­лизованного в геле фермента. Действительно, скорость реакции, катализируемой 0-галактозидазой, иммобилизованной в геле поли-оксйэтилметакрилата, возрастает при измельчении геля и дости­гает максимального значения при уменьшении диаметра гелееых частиц до 120 мкм, оставаясь затем неизменной. Рассмотрим некоторые способы получения иммобилизованных в геле фермен­тов в форме мелких частиц.

Наиболее простой метод заключается в механическом измель­чении блока полимерного геля путем растирания, продавливання через мелкое сито, а также гомогенизации (рис. 8,а). Этот метод»

63

диаметр частиц 1-Ю00 мкм

эмульсия водй/насло

удаление ПАВ

6

овращвннап мицелла

Средний диаметр частиц 001

мнм

вода/масло

Рис. 8. Способы получения иммобилизованных в геле ферментов

в форме мелкнх частиц

однако, имеет ряд существенных недостатков. Получаемые части­цы обладают низкой механической прочностью, являются крайне неоднородными по форме и размерам. Кроме того, молекулы фер­мента, оказавшиеся при измельчении геля на поверхности частиц, легко с нее смываются, что приводит к потерям биокатализатора. Перечисленные недостатки в значительной степени удается

64

преодолеть при использовании эмульсионного способа получения гелевых частиц (рис. 8,6). В этом случае водный раствор, содер­жащий фермент, мономер и инициатор полимеризации, немедлен­но после приготовления вносят в неполярный органический раст­воритель (например, смесь толуола с хлороформом), содержащий поверхностно-активное вещество (ПАВ), и полученную смесь ин­тенсивно перемешивают. В результате образуется эмульсия, со­стоящая из диспергированных в органической среде капель вод­ного полимеризующегося раствора, стабилизированных ПАВ. Пос­ле окончания полимеризации полученные частицы геля сфериче­ской формы отфильтровывают и отмывают водой от непрореаги-ровавшего мономера и ПАВ. В зависимости от условий проведе­ния процесса (концентрация мономера» скорость перемешивания и т. д.) размер получаемых частиц колеблется от нескольких единиц до сотен микрометров. Одно из преимуществ эмульсион­ного способа состоит в том, что благодаря интенсивному тепло-переносу в мелкодисперсной системе устраняется опасность ин­активации фермента под действием теплоты, выделяющейся при полимеризации. Сферические геле вые частицы характеризуются узким распределением по размерам (отклонение от среднего диа­метра составляет ±10%) и высокой механической прочностью, которая может быть в 10 раз выше, чем в случае частиц, получен­ных путем механического измельчения гелевого блока. При исполь­зовании эмульсионного способа необходимо иметь в виду, что не­которые ПАВ, применяемые для получения стабильных эмульсий, могут вызывать денатурацию фермента.

Полимерные частицы геля еще более мелких размеров (нано-частицы), могут быть изготовлены путем полимеризации в так называемых микроэмульсиях (рис- 6,8). Здесь используется свой­ство некоторых ПАВ образовывать в неполярных органических растворителях обращенные мицеллы, способные солюбилнзовать (растворять) водные растворы мономера и фермента. В результате солюбилизации формируется микроэмульсия, состоящая из мель­чайших капелек водного раствора, стабилизированных ПАВ. Размер этих капелек и, соответственно, размер наночастиц, об­разующихся в процессе полимеризации, инициируемой облуче­нием ультрафиолетовым светом, изменяется в зависимости от ко­личества добавленной воды в пределах от нескольких единиц до нескольких десятков нанометров. Полученные наночастицы осаж­дают из органического растворителя ацетоном, отделяют центри­фугированием и высушивают.

Однако применение в технологических реакторах мелких час­тиц иммобилизованного биокатализатора не всегда рационально. Например, излишне мелкие частицы оказывают сильное гидро­динамическое сопротивление потоку при эксплуатации реакторов проточного типа, а в реакторах периодического действия их трудно отделить от реакционной смеси. Поэтому в каждом конкретном случае оптимальный размер частиц определяется с учетом таких

65

факторов, как количество и активность включенного фермента» скорость диффузии субстрата в геле и конструкция реактора.

С практической точки зрения удобен метод так называемой двойной иммобилизации, при котором в гель включается фермент, предварительно иммобилизованный путем адсорбции на твердом носителе, или же получение полимерного геля с включением фер­мента проводится в присутствии такого носителя. Приготовленный таким образом иммобилизованный препарат состоит из частиц твердого носителя, покрытых слоем ферментсодержащего гелн-Метод двойной иммобилизации сочетает преимущества твердой матрицы (большая удельная поверхность, механическая проч­ность, пористость, заданная текстура и форма частиц) и поли­мерных гелей.

Природа полимерной матрицы. Полимерные гели, применяе­мые для иммобилизации, способствуют созданию оптимального микроокружения включенного фермента, что позволяет добиться высокой каталитической активности иммобилизованных препа­ратов. Оптимизация микроокружения достигается за счет подбо­ра соответствующей гелеобразующей системы. Особенно удоб­ными с этой точки зрения являются гели на основе сополиме­ров производных акриловой кислоты. Варьируя химическую природу исходных мономеров и их соотношение, можно полу­чать полимерные матрицы с наиболее подходящими для дан­ной ферментативной реакции характеристиками. В частности, при введении в состав полимера мономерных звеньев, несущих электрический заряд, повышается каталитическая эффектив­ность иммобилизованного препарата в реакциях с участием на­ряженных субстратов. Например, скорость реакции гидролиза положительно заряженного субстрата этилового эфира a-N-бен-зоил-L-аргинина под действием трипсина, иммобилизованного в геле полиакриламида, возрастает при введении в полимерную цепь путем со поли мери заики отрицательно заряженных мономер­ных звеньев акриловой кислоты. Увеличение скорости фермента­тивной реакции объясняется повышенным сродством положи­тельно заряженного субстрата к отрицательно заряженной полимерной матрице.

Аналогичный эффект влияния полимерной матрицы на рас­пределение субстрата между гелем и окружающим его раство­ром наблюдается также в реакциях с участием гидрофобных субстратов. В этом случае увеличение каталитической эффектив­ности иммобилизованного фермента достигается при использо­вании геля, полученного путем сополимеризации с участием неполярных мономеров. Более того, применение гелей на осноне полимеров, обладающих высокой гидрофобностью, позволяет получать иммобилизованные ферментные препараты, способ­ные работать в среде неполярных органических растворителей.

Введение в полимерные цепи геля ионных групп создает вокруг включенных молекул фермента среду, обладающую бу­ферными свойствами. В результате значение рН, при котором

66

функционирует иммобилизованный фермент, может отличаться от рН окружающего частицу геля раствора, что на опыте прояв­ляется в виде сдвига наблюдаемого рН-оптимум а ферментатив­ной реакции. Таким образом, варьируя содержание в геле за­ряженных групп, можно создать вблизи, фермента наиболее благоприятное для него значение рН, не меняя рН внешнего раствора.

Более подробно эффекты микросреды (влияние заряда, гидрофобности носителя и т. п.) в катализе иммобилизован­ными ферментами рассмотрены в гл. IV.