§ 8. Иммобилизация ферментов в гелях, полученных из готовых полимеров

Несшитые полимерные гели. Этот способ иммобилизации основан на свойстве природных полисахаридов, таких, как крах­мал, агар-агар, каррагинан и агароза, образовывать гели при охлаждении их горячих водных растворов. Методика состоит в том, что водную суспензию полисахарида нагревают до темпе­ратуры 80—90Х, добиваясь его полного растворения, и полу­ченный горячий раствор медленно охлаждают. Непосредственно перед началом гелеобразовання .(обычно между 30 и 50°С) в систему добавляют водный раствор фермента. При дальнейшем охлаждении образуется гель, содержащий иммобилизованный фермент. Для улучшений механических свойств иммобилизован­ного препарата процесс гелеобразования иногда проводят в по­рах вспененного полиуретана.

Другим природным полимером, широко применяемым для иммобилизации ферментов, является коллаген — фибриллярный белок соединительной ткани животных. Существует три основ­ных способа иммобилизации ферментов с помощью коллагена: макромолекулярное комплексообразование, нмпрегнирование и электроосаждение. При макромолекул ирном комплексообразова-нии коллаген диспергирует в водном растворе при низких (2,0— 4,5) или высоких (8>5—12,0) значениях рН, вносят фермент и инкубируют смесь в течение 15—20 ч. Затем раствор выливают тонким слоем на инертную подложку и высушивают. В результа­те получается ферментсодержащая белковая мембрана, имею­щая структуру трехмерной сетки из переплетенных фибрилл кол­лагена. Способ макромолекулярного комплексообразоваиин не­применим для иммобилизации ферментов, неустойчивых в кис­лых или щелочных растворах, поскольку он требует длительной инкубации фермента в среде с экстремальными значениями рН. Этого затруднения можно избежать, если проводить иммобили­зацию методом импрегнирования, при котором раствором фер­мента пропитывают уже готовую коллагеновую мембрану.

При иммобилизации методом электроосаждения смесь дис­персии коллагена и раствора фермента помещают между элект-

60

родами и включают электрический ток. Под действием электри­ческого поля молекулы коллагена и фермента мигрируют в на-правлении одного из электродов (в зависимости от рН раствора) и осаждаются на его поверхности в виде мембраны. Этот спо­соб удобен тем, что позволяет получать мембраны заданной толщины и конфигурации при высокой общей скорости процесса. Последнее обстоятельство особенно важно, поскольку снижает вероятность инактивации фермента под действием неблагопри­ятных значений рН.

Сшитые полимерные гели. Введение ковалентных сшивок поз­воляет добиться повышения механической прочности полимерных матриц и более прочного удерживания включенного в них фер­мента. Образование сшивок между полимерными цепями дости­гается, например, при обработке бифункциональными реаген­тами» способными взаимодействовать с функциональными груп­пами полимера. Так, для обработки коллагеновых мембран при­меняется глутаровый альдегид, который используется также при получении сшитых матриц для иммобилизации на основе других белков. Обработке бифункциональными сшивающими реагентами могут подвергаться и полисахаридные гели, рас­смотренные ранее.

Существует также способ включения ферментов в сшитую белковую матрицу, основанный на использовании системы фиб­риноген-тромбин. При этом способе иммобилизации к раствору фибриногена и фермента в водном буфере добавляют белок тромбин, под действием которого фибриноген превращается в фибрин — полимерный белок, образующий трехмерную простран­ственную сетку. Стоимость иммобилизованного таким образом препарата фермента слишком высока, чтобы его можно было рекомендовать для технологических целей, однако он пред­ставляет значительный интерес для медицины из-за отсутствия токсичности и антиген ностн.

Образование прочных связей между полимерными цепями геля может достигаться также за счет электростатических взаи­модействий. Например, в присутствии ионов кальция альгинат натрия дает прочный гель, который широко применяется для иммобилизации ферментов. В этом случае в роли «мостиков» меж­ду полимерными цепями выступают ионы кальция, формирующие ионные связи с карбоксильными группами альгината. На способ­ности полиэлектролитов образовывать гели в присутствии поли­валентных катионов основан также метод иммобилизации с ис­пользованием синтетического пол и электролита — сополимера ма-леинового ангидрида и метилового эфира винилового спирта.

Интересный способ иммобилизации, основанный на употреб­лении полиэлектролитных комплексов, был предложен в 1980 г. В этом случае фермент модифицируют путем ковалентной при­шивки положительно заряженного N-алкилнрованного поливииил-пиридина и вносят в водный раствор полиметакриловой кислоты, несущей отрицательный заряд. В зависимости от ионной силы

61

и рН среды противоположно заряженные полиэлектролиты могут либо сосуществовать в растворе, либо образовывать прочный нерастворимый комплекс, увлекающий фермент в осадок, причем переход между растворимым и нерастворимым состояниями яв­ляется обратным и осуществляется в очень узком диапазоне ион­ной силы или рН. После завершения ферментативной реакции, протекающей в гомогенном растворе, фермент переводят в осадок путем изменения ионной силы или рН и отделяют маточный раст­вор, содержащий продукты реакции. Затем осадок вновь пере­водят в раствор и повторяют весь процесс сначала.

Сшитые гели для иммобилизации могут быть получены на основе других синтетических полимеров. Например, при "воздейст­вии на водные растворы поливинилового спирта или поли винил-пирролидона У"^излУ^{чением ИЛИ} потоком электронов на полимер­ных цепях возникают свободные радикалы, при последующем взаимодействии которых между цепями образуются ко валентные сшивки. Сшитая полимерная матрица для иммобилизации может быть получена на основе кремнийорганического полимера поли-диметилсилоксана- Образование твердого геля происходит в этом случае при введении в систему, содержащую полимер и фермент, вулканизирующего агента, в качестве которого применяется окта-ноат двухвалентного олова.

В последнее время все более широкое распространение находит новый метод иммобилизации ферментов путем их включения в Пилимерную матрицу из фотополимеризующихся смол, которые представляют собой олнгомеры или полимеры (макромономеры), содержащие фоточувствительные функциональные группы. При проведении иммобилизации раствор, содержащий смолу, фермент и инициатор, в течение нескольких минут облучают ультрафио­летовым светом. Активированные облучением фо точу ветви тельные группы образуют между собой ковзлентные связи, в результате чего возникает сшитая трехмерная полимерная сетка с включен­ными в нее молекулами фермента. Этот способ иммобилизации обладает тем преимуществом, что свойства получаемых поли­мерных гелей можно целенаправленно и в широких пределах варьировать, подбирая соответствующие макромономеры,