§ 3. Приемы химической (ковалентнон) им мобилизации белков

\4*еакции образования амидной связи |—С(О)—NH—]. При­соединить белок (Ф) к носителю (Н) или сшивающему агенту (С) посредством амидной связи можно многими путями и при участии различных функциональных групп. Наиболее часто применяется реакция ацилирования аминогрупп фермента. В качестве ацили-рующих агентов широко используются ангидриды:

и хлорангидриды карбоновых кислот:

(Й^—С—NH—@

В случае ангидридного метода в непосредственной близости от возникшей амидной связи в препарате иммобилизованного фер­мента оказывается карбоксильная группа, образующаяся в ходе

№

реакция (1). Это обстоятельство следует учитывать как с точки зрения ее возможного влияния на баланс электростатических взаимодействий в белке и направления локального смещения рН, так и с точки зрения химический стабильности иммобилизоиан-ного препарата: в кислой среде карбоксильная группа может катализировать гидролиз амид но и связи в конъюгате.

В качестве ацилирующих агентов также могут выступать ак­тивированные эфиры (или другие производные карбоновых кис­лот с хорошими уходящими группами), например /ьнитрофенило-вые эфиры:

Реакционная способность активированных производных кар-боновых кислот падает по мере уменьшения кислотности уходя­щей группы (от хлор ангидридов до эфиров).

Перечисление ацилирующкх агентои можно было бы продол­жить и рассмотреть, например, реакции с ацилазидами, образую­щимися из гидразидов карбоновых кислот при их обработке азо­тистой кислотой. Однако новыми здесь будут лишь методы (более сложные) подготовки носителей и сшивающих агентов, тогда как суть проведения самого процесса иммобилизации и тип образуемой связи в конъюгате будут аналогичны тем, которые характерны реакциям (I)— (3).

Принципиально иные реагенты и реакции могут быть заимство­ваны, например, из такой хорошо разработанной области органи­ческой химии, как пептидный синтез, центральной задачей кото­рого является образование амидных связей. В качестве удобных ацилирующих агентов в пептидном синтезе используют производ­ные О-ацклиэомочевнны:

Реакция (4) отражает взаимодействие аминогрупп фермента с носителем или сшивающим агентом, содержащими карбоксиль­ные группы активированные карбодиимндом, R — N=C=^N—R. Ииыми словами, карбодинмнд служит конденсирующим агентом н равным образом осуществляет реакцию образования амид ной связи за счет активированных карбоксильных групп белка и аминогрупп носителя или сшивающего реагента. Ниэкомояекуляр-ные карбодиимиды сами по себе могут рассматриваться как своеобразные сшивающие агенты. Дело в том, что обработка

87

белков такими карбодиимидами может приводить к образованию межмолекулярных и внутримолекулярных амидных связей между карбоксильными и аминогруппами белковых молекул: при этом исходный карбодиимид превращается в соответствующее произ­водное мочевины и не входит в состав возникшего белкового конъюгата. В пептидном синтезе главным образом находит при-менение днциклогексилкарбодиимид, при трансформации кото­рого образуется дициклогексилмочевина — труднорастворимое в воде вещество и поэтому легко отделяемое от водорастворимых целевых продуктов. Это обстоятельство создаёт определенные неудобства при необходимости иммобилизации ферментов на твер­дых носителях. Указанный недостаток устраняется при исполь­зовании растворимых карбодиимидов, имеющих гидрофильные и (или) заряженные группы в боковых радикалах R и R', напри­мер, 1-циклогексил-3-[2-морфолино-(4)-этил]-карбодиимид - ме-топ-тол уолсульфонат

СН₃

Другой пример конденсирующего агента, достаточно широко употребляемого для ковалентной иммобилизации ферментов путем образования амидной связи, также заимствован из пептид­ного синтеза — это изоксазолиевая соль, реактив Вудворда:

-о

_L

(5)

Условия проведения реакции {5) с реактивом Вудворда в общем близки к условиям проведения реакции (4) с карбодиими-дами, разница лишь в том, что в случае реакции (5) применимы и слабощелочные среды. Добавим также, что реакция (5) протекает весьма энергично и в ряде случаев при использовании реактива Вудворда, особенно при его избытке, обнаруживается инактивация ферментоь (например, креатинкиназы и гексокинаэы). У Реакции образования карбамндных связей (производных мочевины: — (NH, О)—С(О, S)—NH—). Химик мочевины, ее предшественником и производных чрезвычайно богата и разно-

образна по реакциям. Именно синтезом мочевины из цнаново­кислого аммония, осуществленным Ф, Велером в 1828 г., было положено начало современной препаративной органической химии. Приведенный пример вполне здесь уместен-» поскольку аналогич­ная реакция может быть с успехом использована для ковалентной иммобилизации ферментов.

Изоцианаты, RNCO_T способны эффективно взаимодействовать с различными функциональными группами белкой с образованием производных мочевины, таких, как диалкилмочевииы, уретаны и у рейды. Наиболее pea кцион неспособны ми группами белков по отношению к изоцнанатам являются аминогруппы:

Аналогичным образом могут быть применены иэотиоцианаты. При этом, соответственно, образуются производные тиомочевины. ■ Одним из самых распространенных методов активации при­родных полисаха рид ных носителей (или синтетических пол иолов) является бромциаковын метод. При обработке бром цианом на таких носителях формируются исключительно реакционноспо-собкые, цианатные, —О—C^N, и имидокарбонатные,

Имидоэфиры могут быть также синтезированы при алкилировании (диметилсульфатом) амидной группы, например, в полиамидах. В свою очередь они легко реагируют с аминогруппами белков с образованием амидинов:

чкы

«яэи

В случае реакции с ншдоэфирами (10) образующаяся в конъю-гате связь химически более прочная, чем в (7) — (9), Дело в том, что характерная особенность конъюгатов, получаемых по реак­циям (7) — (9), заключается в возникновении соединительной группировки уретанового типа, т. е, содержащей сложноэфирную связь. Эта связь может расщепляться под действием нуклеофнль-ных реагентов, в том числе под действием аминогрупп белков:

Эта реакция может быть положена в основу получения сшитых димерон белков или их субъединии (одинаковых или разных) либо ею можно воспользоваться для удалений иммобилизованного фер­мента с носителя. В том же случае, когда отщепление иммобили­зованного белка от носителя крайне нежелательно, следует исходить из других типов носителей, например носителей, содер­жащих вместо гндроксильных групп аминогруппы.

^■/Реакции образования вторичных аминов (связи —NH—), Первичные а- и е-аминогруппы белков могут быть трансформиро­ваны во вторичные в реакциях алкилирования и арилирования, а также путем восстановлений азомегиновых связей (оснований Шиффа). Если в качестве ал копирующих или арилирующих аген­тов использовать соответствующие носители и сшивающие агенты, то образуются конъюгаты, в которых белковая часть фермента закреплена прочной, негидролизуемой азот-углеродной связью, причем вторичный амин легко протонируется и_т таким образом, может нести на себе положительный заряд так же, как исходная аминогруппа.

Хорошо известными алкилирующими и арилирующнми аген­тами служат галогенпроизводные алифатических и ароматических углеводородов, а также метилкетонов- Взаимодействие носите­лей и сшивающих агентов, содержащих активный атом галогена при атоме углерода, с ферментами протекает по схеме {12)

:н,—а

(12)

90

в щелочной среде, требующейся для депротоннрования амино­группы и связывания образующегося хлорида водорода. В этих условиях алкнлируются также тирльные группы цнстеина, ими да-зольные — гнстндина, гидроксильные —- тирозина и, в меньшей степени, алифатические гидроксильные группы белка. В качестве арнлирующих агентов, помимо галогенпроизводных, могут быть применены и сульфопроиз водные. Однако в последнем случае наряду с реакцией алкнлнрования может протекать и реакция сульфирования аминогрупп белка с образованием сульфамидной связи.

В общем число алкилкрующнх и ацнлирующих агентов очень большое. Но особого упоминания заслуживает метод, исполь­зующий хлорпроизводные I Д5-триазнна, в частности цнанурхло-рид, из-за его простоты н надежности. В цнанурхлориде три атома хлора связаны с атомами углерода. В присутствии соедине­ний с HS-, H₂N- и НО-группами происходит быстрое расщепление одной из трех С—СI-связей, затем (более медленно) подвергается расщеплению и вторая группа, а третья обычно в реакции арнлн-рования участия не принимает (время иммобилизации около суток при 4°С). Циа нурхлорид может быть с успехом применен для активации носителей, например полисахаридов, а также как бифункциональный сшивающий или вшиваемый агент.

Исключительно эффективными алкилнрующнми агентами яв­ляются такие производные олефинов, как и мины, оксиды и тио-оксиды {оксираны и тнираны):

где X = :>NH,>O,>S

Реакцию (13) можно проводить в средах с различными зна­чениями рН, причем от выбора рН существенно зависит на прав-леи не реакции: по амино- или оксигруппам белка.

Реакции как алкилнронання, так и арилирования можно про­вести путем присоединения фермента (посредством его тнольных, амино- и гидроксильиых групп) по активированным двойным связям. Для этой цели используют гидроксилсодержащие носи-тели, предварительно активированные дивинилсульфоном или бензохнноном. Процесс иммобилизации можно представить, со­ответственно, схемами (14) и (15):

91

Реакции активации носителей бензохиноном и последующего присоединения к таким носителям фермента правильнее было бы называть окислительным арнлированнем, поскольку в качестве промежуточных группировок в них образуются^ гидрохиноновые, которые, в свою очередь, окисляются хнноном или растворенным кислородом воздуха (среда щелочная, что благоприятствует про­цессу окисления).

Если теперь вернуться к рассмотренным реакциям (I)—(15), то можно констатировать, что все эти реакции в общем-то неспе­цифические и помимо аминогрупп в них могут принимать участие, как это уже отмечалось, другие функциональные группы: тиояь-ные, имидазольные, гидрофильные. Одним из наиболее распро­страненных методов специфической модификации аминогрупп бел­ков является образование азометнновых связей, — CH=N—, в реакциях белков с альдегидами (16):

Продукты конденсации амино- и альдегидсодержащих соеди­нений — основания Шиффа — образуются легко и быстро в ще­лочных средах и в этих условиях весьма стабильны. Особенно широкое распространение в методах иммобилизации получили диальдегиды, такие, как глутаровый альдегид, используемый в качестве сшивающего агента. При применении ннзкомолеку-лярных альдегидов, в том числе глутарового, необходимо учи­тывать возможность образования разнообразных побочных про­дуктов полимеризации и пол и конденсации уже в исходных реа­гентах. В результате при действии глутарового альдегида на фермент помимо оснований Шиффа могут возникать и другие конъюгаты, в том числе связанные через вторичные амины.

Характерной особенностью азометиновой связи является то, что она легко разрушается в кислых средах с регенерацией исход­ных веществ реакции (16). Это ее свойство может использоваться для удаления с носителя ковалентно иммобилизованного фермента путем простого изменения рН среды. Очевидно также, что азоме-тиновая связь непригодна для ковалентной иммобилизации фер ментов, предназначенных для работы в кислых средах. Однако устойчивости конъюгатов с азометиновой связью к кислотам мож­но добиться путем восстановления згой группировки:

Реакция (17) приводит к образованию вторичного амина, проч­ной ко валентной связующей группировки между белком и носите­лем или сшивающим агентом.

Взаимодействие альдегидных и аминогрупп можно осуществить и таким образом, чтобы сразу (в один прием) получить прочный конъюгат. Примером такого процесса служит метод Уги, который схематически может быть представлен реакцией (18):

Ж ^ХН

+ R,—С(О>—N(R₂)—CH{R₃)—C(O)— NH—R₄ (18)

Как видно из схемы, помимо альдегидных и амннных групп в реакцию (18) вступают соединения с карбоксильной группой и изо нитрилы с образованием амид ной связи между белком и носи­телем. Иными словами, по методу Уги ферменты можно ко ва­лентно иммобилизовать на носителях, содержащих альдегидные группы, в присутствии изоцианатов как по амино-, так и карбо­ксильным группам. Равным образом иммобилизация может быть осуществлена на носителях, содержащих изонитрильные группи­ровки о присутствии низкомолекулярных альдегидов. \ЙРеакции азосочетання (образование азосоедннеинй со связью —-и —N—). Соли диазония [Аг—N=N1 ⁺ C1~ способны всту­пать в различные реакции сочетания, скорость которых и направ­ление существенно зависят от рН среды и природы ароматиче­ского субстрата. В реакциях ааосочетания могут, в принципе, участвовать а минные, гуаниднновые, тнольные, имидазольные и фенольные группы белков, причем в ряде случаев с одной функ­циональной группой могут реагировать две диазогруппы.

В слабощелочной среде основной группой-мишенью в белке является фенольный радикал тирозина (атаке ионом диазония в этих условиях может также подвергаться незащищенный незаря­женный имидазол гнетидина):

N/Реакции тнол-дмсульфидного обмена (образование дисуль­фид ной связи» —S —S—). В предыдущем разделе было отмече­но, что свободные сульфгидрильные группы в белках встречаются

УЗ

доволно-такн редко из-за ярко выраженной способности к окисле­нию и образованию в нативных условиях дисульфидных мости­ков — сшивок, которые, однако, в белках нетрудно восстановить до исходных сульфгидрильных групп- Способность к созданию дисульфидных мостиков может быть использована для ковалент-ной иммобилизации ферментов путем формирования межмолеку­лярных дисульфидных связей по реакции (20):

-SH + HS—® ^[Р| ■ @h~S—S—(ф) (20)

Окисление сульфгидрильных групп до дисульфидных проте­кает спонтанно под действием растворенного кислорода воздуха. С целью увеличения содержания тиольяых групп в исходном белке проводит восстановление дисульфидных связей подходящим вос­становителем, например боргидридом натрия, меркаптоэтанолом, дитиотреитолом, цистеином или его производными. Однако реокис-ление тиолькых групп при проведении реакции (2Q) может приво­дить к образованию «неправильные внутримолекулярных дн-сульфидных мостиков в белке и, таким образом, сопровождаться существенной потерей каталитической активности иммобилизо­ванного фермента. Содержание сульфгндрнльных групп в белке можно увеличить за счет введения эндогенных групп, т. е. тиолк-рованием. Для этого, избрав в качестве групп-мишеней амино­группы белка, обрабатывают их подходящими ацнлнруюшими или алкилирующими реагентами, содержащими защищенную сульфгидрильную группу, например тиолактоном гомоцистеина. Пример указанного реагента интересен тем, что при его исполь­зовании в белке увеличивается содержание сульфгидрильных групп, тогда как число аминогрупп не изменяется (а- и Е-амино-группы белка образуют с реагентом амидную связь, однако реа­гент несет на себе собственную а-аминогруппу, а также сульфгид-рильную, формируемую при раскрытии лактонного кольца).

В общем случае удобным приемом ковалентной иммобилиза­ции ферментов путем образования дисульфидных мостиков явля­ется исиользонание реакций тнол-дисульфидного обмена (при этом резко уменьшается вероятность закрепления «неправиль­ных* дисульфидных внутримолекулярных мостиков в белке)-Суть этого процесса можно выратчить реакцией (21)"

R,— S—S^R₂ + HS— R^Rl— S—S— Ra + HS — R₂ (21)

где Ri. R_a и R₃ могут представлять собой белок, носитель, сши­вающий агент и (или) радикал низкомолекулярного тиола. Реак-ции тиол-дисульфидного обмена обычно происходят в сильно-кислой среде, но могут катализироваться тиольными анионами в нейтральных и щелочных растворах. Примером иммобилизации ферментов по реакции (21) может служить взаимодействие белка с носителем, содержащим дитионитробензойную группу:

94

оо

В этом методе присоединение фермента к носителю удобно кон­тролировать спектрофотометрически (Я —412нм, е= 13 600) по количеству освобождающегося тионитробензоата.

Важным достоинством методов иммобилизации, основанных на реакции тнол-дисульфидногр обмена, является простота про­цедуры как присоединения фермента к носителю, так и отщепле­ния (под дейстпием низкомолекулярного тиола).

Радикальные реакции (графт-сополкмернзация). Одним ил распространенных приемов получения синтетических полимерных материалов служит графт-сополимеризация, осуществляемая, например, путем химической прививки одного полимера к дру­гому. Эта цель достигается при рекомбинации макрорадикалов, образующихся в исходной смеси полимеров при воздействии мощного источника -у-излученин. Нетрудно представить себе ана­логичную ситуацию, когда п роли одного из компонентов смеси выступает биополимер, фермент. Однако жесткое облучение ферментов сопровождается, как правило, их необратимой инакти­вацией. Потери ферментативной активности могут быть суще­ственно снижены при переходе к фотоиницннруемым реакциям. Примером фотореактивных агентов являются ал кил- и арила-эиды, которые, в свою очередь, могут входить в состав носите­лей или сшивающих агентов. При фотохимическом распаде таких соединений образуются молекулы азота и короткоживу-щие (0,1 —10 мс) высокореакционнеспособные радикалы — нит-рены:

R—N₃ &. R—N + Н_а

взаимодействующие практически с любыми группами белка с образованием прочных ко валентных связей.