§ 3. Эффекты распредепения реагентов в катализе иммобилизованными ферментами

Распределение субстрата, Б условиях равновесного распре­деления субстрата между раствором н ферментсодержащей матрицей Км.мж» входящая в уравнение (I), определяется сле­дующим выражением:

JW™ = К_МЯ, (2)

где Хм — значение константы Михаэлиса реакции, катализи­руемой свободным (нейммобилизованным) ферментом; Р — коэф~ фнциент распределения субстрата> который задается формулой

где [S]^p и \S]^H — концентрации субстрата в растворе и в матрице носителя соответственно.

Из уравнения (1) следует, что при высоких концентрациях субстрата (|5|»Км.*«ж) эффекты распределения не играют существенной роли, поскольку в этом случае скорость фермента­тивной реакции У = й_кат[£], т. е. не зависит от концентрации субстрата. Если же концентрация субстрата невелика ([5]<A_W(seHt), то анализ уравнений (I) —(3) показывает, что концентрирование субстрата в матрице (Р<:1) приводит к уменьшению значения /См,***, т. е. к возрастанию скорости ферментативной реакции. В тех же случаях, когда Р>1, скорость ферментативной реакции падает вследствие возрастания Ям.квж.

Неравномерность распределения субстрата в системе обус­ловлена его взаимодействием с матрицей за счет, например, электростатических сил, водородных связей, гидрофобных взаи­модействий н т. п. В случае электростатических взаимодействий установлена количественная взаимосвязь между коэффициентом распределения Р н характеристиками субстрата и матрицы:

^*), (4)

где е — единичный заряд электрона; Z — заряд субстрата, кратный заряду электрона; ^ — электростатический потенциал носителя; k константа Больцмана; Т — абсолютная темпе­ратура.

В заключение отметим, что в случае тех ферментов, которые характеризуются низким сродством к субстрату (высокое зна­чение Км) или действуют на плохо растворимые субстраты (предел растворимости субстрата ниже значения Кил)> выбор носителя для иммобилизации приобретает первостепенное зна­чение. В этих случаях, подобрав носитель, для которого коэф­фициент Pj>U можно добиться существенного увеличения скоро­сти ферментативной реакции [см. уравнения (1) — (3)].

Диффузионные ограничении в катализе иммобилизованными ферментами. Если молекула фермента находится на поверхности (или внутри) частицы носителя, то для протекания ферментатив­ной реакции необходимо, во-первых, чтобы молекула субстрата подошла к поверхности частицы, и, во-вторых, продиффундиро-вала внутрь нее. В зависимости от того, как соотносятся скорости диффузионных стадий и непосредственно ферментативной реакции, может реализоваться одна из трех нижеперечисленных ситуаций.

Если ферментативная реакция в поверхностных слоях час­тицы протекает быстрее, чем субстрат из раствора подходит к поверхности, то через непродолжительное время вокруг части­цы образуется зона, обедненная субстратом. В результате наблюдаемая скорость ферментативной реакции будет опреде­ляться скоростью массопереноса субстрата к частице. В этом случае говорят, что процесс контролируется внешней диффу­зией.

101

Если массоперенос субстрата проходит быстрее, чем идет ферментативная реакция на поверхности частицы» то может возникнуть другой тип диффузионных затруднений. А именно, если размер частицы носителя велик» а фермент очень активен (или велика его плотность внутри частицы), то практически весь субстрат израсходуется уже в приповерхностных слоях носителя, а глубинные области будут обеднены субстратом. В таком случае говорят» что процесс контролируется внутренней диффузией.

И наконец, когда диффузия субстрата как к поверхностному слою, так и во внутренние области частицы проходит достаточно быстро, общая скорость превращения субстрата определяется непосредственно ферментативной реакцией. В этом случае гово­рят о кинетически контролируемом процессе.

Учет диффузионных факторов является одним из наиболее сложных вопросов в катализе иммобилизованными ферментами. В рамках уравнения Михаэлнса—Ментен [уравнение (l)J будет проанализировано влияние диффузионных факторов на эффек­тивные кинетические параметры ферментативной реакции.

Внешнедиффузионное торможение. К поверхности частицы носителя примыкает неперемешиваемыи слой жидкости, в преде­лах которого перенос молекул происходит исключительно за счет молекулярной диффузии. Поскольку молекулярная диффу­зия в жидкостях проходит очень медленно {с коэффициентом диффузии 10~^s—IO^cmVc), массоперенос может стать лимити­рующей стадиен процесса, катализируемого иммобилизованным ферментом.

Согласно первому закону Фика диффузионная скорость по­дачи субстрата /, отнесенная к единице площади поверхности частицы носителя, пропорциональна градиенту концентрации субстрата, При наиболее часто распространенном случае линей­ного градиента концентрации

(5)

где р — коэффициент массо пере носа; So и 5 — концентрации субстрата в растворе и в частице с иммобилизованным фермен­том соответственно.

При достижении стационарного состояния в системе, т. е. когда скорость диффузионного потока субстрата равна скорости его расходования в ферментативной реакции, справедливо сле­дующее уравнение:

где буквенные символы обозначают те же параметры системы, что и в уравнениях (I) — (5).

Проанализируем частные случаи уравнения (6). В условиях насыщения фермента субстратом (Km, *_aw <£; [S]) кинетика фер­ментативной реакции описывается нулевым порядком по кои-

102

центрами и субстрата и ферментативный процесс не может лими­тироваться диффузией, т. е. всегда протекает в кинетическом режиме,

В случае, когда /См._каж 2>[S|. т. е. когда кинетика фермен­тативной реакции подчиняется уравнению первого порядка, имеем следующее выражение для стационарной скорости фер­ментативной реакции:

Анализ выражения (7) показывает, что возможны два край­них случая. Если р >• k_K&t\ Щ/Км.ыж, т. е. массоперенос осу­ществляется намного быстрее, чем идет ферментативная реак-

цня, то v — "^aTl ' [So]. В этом случае реакция проходит в ки-

1\(Л кгж

нетическом режиме. Если же ферментативная реакция идет на­много быстрее массопереноса, т. е. Э <£ кьат{Е]/Кгл.*а»., то ч-= р[5] и ферментативный процесс протекает в диффузионном режиме.

В общем случае, когда К(л,*аж ~|S], т. е. кинетика фермен­тативной реакции характеризуется дробным порядком по суб­страту, несмотря на существенно более громоздкие выражения, по-прежнему справедлив вывод о двух режимах протекания ферментативного процесса - - кинетическом и диффузионном.

Можно ли решить заранее, в каком режиме, кинетическом или диффузионном, будет протекать ферментативная реакция? Для этого прежде всего необходимо оценить параметр р. Срав­нив его со значением 1ь*ят[Е\/Кн,кяж, можно, в принципе, сде­лать вывод о режиме (кинетическом или диффузионном) про­текания ферментативной реакции [см. уравнение (6)].

Этот путь, однако, дает слишком приближенные оценки, поэтому им относительно редко пользуются на практике. Чаще используют экспериментальные критерии. Рассмотрим основные из них.

Зависимость скорости ферментативной ре­акции от концентрации субстрата. Как уже отме­чалось, в условиях насыщения иммобилизованного фермента субстратом, т. е. при достаточно высоких его концентрациях, ферментативный процесс, в принципе, не может контролиро­вался диффузией субстрата, и. следовательно, реакция проте­кает в кинетической области. Однако по мере уменьшения концентрации субстрата повышается вероятность перехода реак­ционной системы в диффузионную область. Поэтому по экспе­риментальной зависимости и от S в координатах Лайнуивера — Берка (рис. 15) наблюдается четко выраженный излом: при концентрациях субстрата выше значения в точке излома (т. е. при низких значениях 1/[5]) реакция проходит в кинетическом режиме— прямая /, а при низких концентрациях субстрата (вы­соких значениях 1/[ S\) в диффузионном режиме—прямая 2. Таким

юз

1/v

образом, если для иммоби­лизованного фермента в координатах Ланнуиве-ра — Берка получена за­висимость, аналогичная представленной на рис. 15, это является существен­ным указанием на то, что диффузия играет в процес­се важную роль.

1/fSJ

Рис, 15. Гипотетическая зависимость скорости реакции, катавизируемой иммобилизованным ферментом, от концентрации суйстрзтя к v,o-ординатах Лайнуивера—Берка, осложненная виешнеднффузнонными ограничениями

Температурные зависимости. Фер­ментативные реакции ха­рактеризуются обычно энергиями активации по­рядка 40—120 кДж/моль. В то же время скорость процессов, протекающих в диффузионной области, должна слабо зависеть от температуры; поскольку

единственный чувствительный к температуре параметр D ха­рактеризуется энергией активации порядка 15—20 кДж/моль. Следовательно, слабая зависимость скорости реакции, катали­зируемой иммобилизованным ферментом, от температуры может служить указанием на то, что процесс протекает в диффузион­ном режиме. Однако с повышением температуры реакция мо­жет переходить из кинетической области в диффузионную, поскольку Э и VfKm в уравнении (7) по-разному зависят от температуры.

Зависимость скорости реакции от удель­ной концентрации иммобилизованного фер­мента (количества активного фермента на I г носителя). Как видно из анализа уравнения (7), скорость реакции в диффузион­ной области не должна изменяться при возрастании удельной концентрации иммобилизованного фермента. Кроме того, ско­рость диффузионно-контролируемых реакций не должна также зависеть от таких факторов, как изменение рН, ионной силы, добавление ингибиторов и активаторов, которые оказывают спе­цифическое влияние исключительно на ферментативные стадии (что легко проследить в случае натнвного фермента). Следует, однако, учитывать, что для одного и того же препарата иммоби­лизованного фермента реакция со специфическим (высокореак-ционнеспособным) субстратом может быть диффузионно контро­лируемой, а с неспецифическим субстратом (менее реакционно-способным) протекать в кинетической области.

Зависимость скорости реакции от степени измельчения частиц с иммобилизованным ферментом. Скорость реакции в кинетической области не

104

должна зависеть от степени измельчения частиц, содержащих катализатор (если, конечно, нет внутридиффузионных затрудне­ний для субстрата, см. ниже). С другой стороны, скорость диф-фузнонно-контролируемых реакций будет возрастать по мере уменьшения размера частиц с иммобилизованным ферментом, по­скольку такое уменьшение приводит к увеличению диффузионно­го параметра р в уравнении (7).

Зависимость от скорости перемешивания. Влияние диффузионных факторов ослабляется по мере ускорения массопереноса путем более интенсивного перемешивания. Этот вывод становится особенно очевидным, если встать на позиции представлений о неперемешиваемом слое (слое Нернста) как о физической реальности» для которой применим первый закон Фика. Из гидродинамики следует, что толщина неперемеши-ваемого слоя уменьшается при увеличении скорости потока жид­кости вокруг частицы. Таким образом, зависимость наблюдаемой скорости ферментативной реакции от скорости перемешивания или скорости протока субстрата указывает на существенную роль диффузии в процессе. Увеличение скорости протока субстрата через колоночный реактор и повышение числа оборотов мешалки в реакторе перемешивания должно ослабить диффузионные огра­ничения. Существенное ускорение перемешивания может, в прин­ципе, перевести реакцию из диффузионной области в кинетическую.

Внутридиффузионное торможение. Реакция, катализируемая ферментом, иммобилизованным внутри частицы (например, включенным в полимерный гель), может оказаться чувствитель­ной к торможению за счет внутренней диффузии. Иными слова­ми, скорость ферментативной реакции может лимитироваться скоростью проникновения субстрата внутрь частицы. Внутридиф­фузионное торможение ферментативных реакций зависит от фор­мы частицы с иммобилизованным ферментом.

Рассмотрим следующую модель. Имеется плоская мембрана толщиной /, содержащая иммобилизованный фермент с концен­трацией в мембране [£]. Мембрана погружена в раствор субстра­та, концентрация которого равна [5]. Коэффициент распределе­ния субстрата между раствором и мембраной равен Я. Требуется найти зависимость между скоростью появления продукта в растворе и кинетическими параметрами (к_кат и Кн. «**) фермен­тативной реакции.

В соответствии со вторым законом Фика скорость диффузии

субстрата в мембрану (в направлении х, перпендикулярном ее поверхности — см. рис. 16) равна D--V , где D — коэффици­ент диффузии субстрата. В стационарном состоянии системы скорости ферментативной реакции, задаваемой уравнением Ми хаэлиса —Ментен [уравнение (1)], и диффузии субстрата равны. Этому условию соответствует следующее равенство:

п

105

sinhui

а выражение (10) отличается от обычного уравнения Михяэлиса — отсутствие внутридиффузионных

ограннчений, лишь множителем F, который называют фактором эффективности и который отражает влияние внутридиффузион­ных ограничений на ферментативный процесс. На рис. 17 прине­сена зависимость F от al. При at^\ F отличается от единицы не более чем на 10%, т. е. влиянием диффузии на кинетику ферментативной реакции можно пренебречь. При ai> I F заметно меньше единицы. Иными словами, отличие а/ от единицы может служить критерием влияния диффузии на скорость реакции, ката­лизируемой иммобилизованным ф^ерментом.

3. [S]o ~ Лм, мж. В этих условиях получаем следующее выра-

x-0 x-f

Рйс. 16. Схематическое изображе­ние диффузии субстрата в плоскую мембрану толщиной I

Ментен, справедливого в

Прямая / описывает распределение субстрата в начальццн момент вргм^ ни (/^0}l лрнчвя 2— равновесное распределение субстрата в отсутствие фермент атнвкой резкий и в мембране; криеая 3 — распределение субстрата при наличии ферментативного процесса в мембране после установления ста­ционарного состоя и и н

При анализе уравнения (8) воз­можны три частных случая.

1. [Sj_o>/C_M-И1Ж. Тогда выра­жение скорости ферментативной реакции, отнесенной к единице объема матрицы (v)_t примет сле­дующий вид:

Очевидно, что в этом случае диф­фузия не влияет на скорость фер­ментативной реакции,

2- [5]₀ < /Смкйж- Тогда спра­ведливо выражение

v

,(Ю)

2 cosh a/ - 1

каж

sin h al

где а =

i — толщина

мембраны.

Видно, что вклад диффузии учи­тывается фактором F

_с

al