§ 4. Недостатки и преимущества получения

и использования ковалентно иммобилизованных ферментов

При описании методов ковалентной иммобилизации после рассмотрения основных химических приемов для их иллюстрации обычно приводят конкретные практические методики. Дело в том, что объективный общий сравнительный анализ различных мето­дов крайне затруднителен, если вообще возможен, поскольку ни одному из указанных в предыдущем разделе приемов не может быть отдано абсолютное предпочтение. Накопленный экспери­ментальный материал свидетельствует, например, о том, что использование одного и того же метода r качестве стандартной процедуры приводит в случае различных ферментов к резко отличающимся конечным результатам [уровню остаточной актив

95

кости и (или) стабильности). Более того, характеристики полу-чаемых методами ковалентной иммобилизации ферментных пре­паратов существенным образом зависят от исходного образца фермента (в частности, от процедуры его выделения и очистки), природы носителя, чистоты используемых реагентов и т. д. Не последнее место в этом перечне занимают личный опыт и квали­фикация экспериментатора, В этой связи отметим, что те условия реакций, которые были указаны в предыдущем разделе, ориен-тиротючны.^<ороче говоря, химическая иммобилизация фермен­тов в целом является искусством, уровень которого определя­ется, в первую очередь, умением экспериментатора (уровнем его научного мышления, способностью к целенаправленному поиску оптимальных условий для реализуемого процесса). Тем не ме­нее одну общую рекомендацию к разработке процедуры хими­ческой иммобилизации можно дать.

Напомним» что основная задача экспериментатора заключается & формировании новых ко валентных связен в молекуле фермента при использовании функциональных групп, не существенных для проявления его каталитической активности. Следовательно, при химической модификации фермента его активный центр жела­тельно защищать — ковалентно или нековалентно. Для этого можно употреблять обратимые ингибиторы, субстраты» различ­ные защитные реагенты. В ряде случаев для иммобилизации могут быть применены каталитически неактивные предшествен­ники ферментов, зимогены, превращаемые в соответствующие ферменты после завершения стадии ковалентной фиксации.

При сопоставлении различных приемов иммобилизации хи­мические методы для крупномасштабных процессов кажутся малопривлекательными из-за сложности и дороговизны. Действи­тельно, сегодня нельзя с достоверностью назвать ни одного промышленного процесса с ковалентно иммобилизованными фер­ментами — обычно в них используются те или иные методы физической иммобилизации.

Иная ситуация сложилась в лабораторной практике, где химические методы иммобилизации занимают доминирующее положение. Без них немыслимы аффинная хроматография, имму-ноферментный анализ, тонкий органический синтез особо чистых препаратов и многие другие процедуры. Кроме того, в химиче­ской сложности и гибкости методов ковалентной иммобилиза­ции заложены широкие возможности создания препаратов иммобилизованных ферментов со строго определенными и контролируемыми свойствами, что особенно важно для целей медицины н высокочувствительных методов анализа (детекции)

Глава КИНЕТИКО Ш\ ТЕРМОДИНАМИЧЕСКИЕ Ж I ЗАКОНОМЕРНОСТИ КАТАЛИЗА в 9 ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ I ФЕРМЕНТАМИ

Кинетика действия ферментов в растворе является одним из наиболее хорошо изученных разделов химической энзимологии. Кинетические закономерности катализа простыми ферментами подчиняются уравнению Михаэлиса—Ментен, предложенному еще в начале века. Кооперативные и аллостерические эффекты r катализе более сложными ферментами (в частности, олиго-мерными) описываются на основе модели Моно -Уаймена— Шанже, сформулированной в 60-х годах. Хорошо разработана теория влияния на кинетику ферментативных процессов таких факторов, как рН, присутствие ингибиторов и активаторов и т. п. Несколько более сложными закономерностями характеризуется кинетика действий ф£>рмснтов ня высокомолекулярные, в том числе, нерастворимые субстраты (белки, ДНК и РНК, целлю­лозу). Однако и в этой области достигнут -очевидный прогресс-Закрепление катализатора на носителе создает целый ряд принципиальных трудностей для описания кинетических законо­мерностей. Не случайно общая теория гетерогенного катализа до сих пор не создана. В дальнейшем изложении будет сделана попытка выявить те основные факторы, которые определяют кинетические закономерности катализа иммобилизованными фер­ментами, и выяснить, как изменяются каталитические характе­ристики иммобилизованных ферментов по сравнению с натив-нымн ферментами в растворе.