§ 17. Микромульемм

Проблема увеличения поверхности раздела фаз может быть решена при использовании в качестве среды для ферментативных реакций уже упоминавшихся выше микроэмульсий типа «вода в масле» {см. рис. 8, в), введенных в арсенал энзимологии К- Мартинеком с сотр. (1977). Методика получения фермент-содержащих микроэмульсий состоит в том, что фермент в виде водного раствора (в количестве нескольких объемных процентов от общего объема системы) или л иофил изо ванного порошка вно­сят в раствор ПАВ в неполярном органическом растворителе и энергично перемешивают в течение нескольких минут (при вве­дении фермента в сухом виде для обеспечения его солюбилизации в систему необходимо заранее добавить нужное количество вод­ного буферного раствора). В результате образуется полностью прозрачный гомогенный раствор, в котором молекулы фермента включены внутрь гидратированных обращенных мицелл ПАВ, или микроэмульсионных капель, причем в каждой белоксодер-жащей мицелле присутствует обычно только одна молекула фер­мента (рис. 10,е). Диаметр сферических капель в зависимости от ряда факторов (природа органического растворителя и ПАВ, количество добавленной воды и т. п.) колеблется от нескольких единиц до 20 нм.

73

органический растворюсь

водный раствор Фермента

пористого носителя

спирт

а — двулфазяая сменена типа «вода иссушивающийся с во дай органический растворитель», б — частица крупнопористого неорганического носители, пропитанная подным раствором фер­мента, в органическом растворителе; в — фермент, включенный б г«драгированную обращенную мнцеллу ПАВ в органическом растворителе. <; фермент, включенный в водною мнкрокатглю

й микроэмульеми

Ограничения, накладываемые на скорость ферментативной реакции диффузией субстрата и продукта, в мнкроэмульснях практически отсутствуют из-за огромной удельной поверхности раздела между водными микрокаплями и органическим раство­рителем. Дополнительное преимущество таких систем состоит в том, что фермент, находящийся внутри мнкроэмульсионной капли, защищен от денатурирующего воздействия органического растворителя слоем молекул ПАВ, как это показано на рис. 10, в. Микроэмульсии представляют собой универсальную микрогетеро­генную среду длн ферментативных реакций: практически все из нескольких десятков ферментов различных классов, изученных в микроэмульсионных системах, полностью сохраняют, а иногда

74

даже приобретают более высокую каталитическую активность по сравнению с водным раствором.

После завершения ферментативной реакции в микроэмульсии фермент можно регенерировать для повторного использования, например, путем добавления в систему избытка ацетона. Фермент при этом выпадает в осадок в виде так называемого ацетонового порошка, сохраняя каталитическую активность, тогда как основ­ная доля ПАВ вместе с продуктом реакции остается в растворе. Последнее обстоятельство является одним из основных недостат­ков микроэмульсий как среды для проведения ферментативных реакций, поскольку отделение продукта от примеси ПАВ нередко представляет собой весьма трудную задачу.

Затруднений такого рода можно избежать, если использовать так называемые бездетергентные микроэмульсии, для образова­ния которых вообще не требуется введения ПАВ, Бездетергент­ные микроэмульсии образуются в тройных системах типа гек-сан — изопропиловый спирт — вода или толуол — изопропило­вый спирт — вода. При определенном соотношении компонентов вода в таких системах существует в виде сферических капель размером от 5 до 30 нм, стабилизированных адсорбированными на их поверхности молекулами изопролилового спирта. При ра­створении в бездетергентной микроэмульсии молекулы фермента оказываются включенными в водные микрокапли, как это показа­но на рис. 10, г, причем их каталитическая активность сохра­няется. Для отделения фермента от реакционной смеси после завершения реакции можно просто изменить состав системы путем добавления одного из компонентов, в результате чего произойдет ее расслоение на водную и органическую фазы, содержащие, соответственно, фермент и продукт реакции.

Важнейшим преимуществом системы двухфазного типа на основе воды и неполярного органического растворителя явля ется то, что они дают возможность легко осуществлять фермен­тативные превращения соединений, нерастворимых в воде, но растворяющихся в органической фазе. Кроме того, благодаря низкому содержанию воды в таких системах удается проводить реакции, равновесие которых в водном растворе по термодинами­ческим причинам почти полностью сдвинуто в сторону исходных веществ. Речь идет прежде всего о реакциях, протекающих с образованием воды в качестве одного из продуктов» таких» как синтез пептидов, сложных эфиров и т. п.

$ 18. Двухфазные водные системы

В основе этого способа иммобилизации, предложенного Б. Ма-тиассоном (1982), лежит тот факт, что водные растворы некото­рых полимеров (полиэтиленгликоля, дскстрана, поливинилового спирта и других) обладают свойством не смешиваться между собой или с концентрированным водным раствором электролита, образуя системы двухфазного типа. Обычно используемые кон-

75

центрации полимеров в обеих фазах лежат в интервале от 5 до 15%. Наибольшее распространение получили системы, со­стоящие из несмешивающихся между собой водных растворов полиэтиленглнколя и декстрана, один из которых диспергирован в другом в виде мелких капель. Варьируя природу входящих в систему компонентов и объемное соотношение фаз, можно подобрать условия, при которых фермент и продукты реакции находятся преимущественно в разных фазах, что позволяет отделить продукты реакции от биокаталнзатора. Примером ис­пользования этого подхода может служить гидролиз крахмала под действием смеси а-амплазы и амилоглюкозидазы в двух­фазной системе, состоящей из несмешивающихся друг с другом водных растворов крахмала и полиэтилен гликоля.

Наряду с рядом важных достоинств, к числу которых можно отнести почти полное отсутствие диффузионных ограничений при протекании реакции, простоту приготовления и доступность необходимых компонентов, двухфазные водные системы имеют однако, серьезные недостатки. Главный из них — это то, что вследствие эффектов распределения часть фермента, хотя и не­большая, всегда переносится в фазу, содержащую продукты реакции. Это приводит к загрязнению продуктов и потерям дорогостоящего катализатора. Чтобы избежать этого нежела­тельного явления, приходится применять дополнительные устрой­ства, например мембранные ультрафильтры, что приводит к за­медлению и удорожанию всего процесса.

_Глава

Главным отличительным признаком химических методов им­мобилизации является то, что^путем химического воздействия на структуру фермента r его молекуле создаются ноные коиа-Д£цтнык-еая»и^в частности между белком и носителем^—

Препараты иммобилизованных ферментов, полученные с при­менением химических методов, обладают по крайней мере двумя важными достоинствами. Во-переых/ковалентная связь фермен­та с носителем обеспечивает высокою прочность образующегося конъюгата. Иными словами, 7гр*Г'доетатЪ<П5о~~Ж1Т]5оком варьиро­вании условий, таких, как рН и температура, фермент не десор-бируется с носителя и не загрязняет целевых продуктов катали­зируемой им реакции. Это особенно важно при реализации процессов медицинского и пищевого назначения, а также для обеспечения устойчивых, воспроизводимых результатов в анали­тических системах. Во-вторых, ^/химическая модификация ферментов способна приводить ^существенным изменениям их свойств, таких, как с^еддадцщццец^^ность, каталитическая активность и стабильность. Именно химическими методами, путем многоточечного ковалеитного закрепления белковой струк­туры удается достигнуть наибольших эффектов стабилизации ферментов.