§ 3. Природа адсорбционных взаимодействий фермента с носителем

Удерживание адсорбированной молекулы фермента на поверх­ности носителя может обеспечиваться за счет иеспецифических ван-дер-ваальсовых взаимодействий, электростатических взаимо­действий, водородных связей и гидрофобных взаимодействий между носителем и поверхностными группами белка. Относи­тельный вклад каждого из типов связывания зависит от хими­ческой природы носителя и функциональных групп на поверх­ности молекулы фермента. В большинстве случаев основную роль в связывании фермента играют электростатические взаимодейст­вия и водородные связи. Взаимодействия с носителем могут оказаться настолько сильными, что сорбция б покатал и затор а будет сопровождаться разрушением его структуры. Например» при адсорбции некоторых растительных клеток на гранулах цитодекса клеточная стенка деформируется, повторяя рельеф поверхности частиц носителя.

$ 4. Влияние различных факторов

на адсорбцию ферментов на носителе

Протекание процесса адсорбции и прочность связывания фер­мента с носителем в значительной степени зависят от условий проведения иммобилизации. Основными факторами, влияющими на адсорбцию фермента» являются удельная поверхность и по­ристость носителя, значения рН и ионной силы раствора фер­мента, его концентрация и температура проведения процесса адсорбции.

Удельная поверхность и пористость носителя. Сорбционная емкость носителя пропорциональна его удельной поверхно­сти. В приложении к белкам (ферментам) эта закономерность, однако, действует только в том случае, когда носитель непорис­тый или когда диаметр пор намного превосходит размер бел­ковых молекул. Если же поры настолько малы, что не могут вместить молекулу фермента, то для белка оказывается доступ­ной только часть общей поверхности, т. е. сорбционнан ем­кость носителя по отношению к ферменту небольшая, несмотря на очень большую общую удельную поверхность. Критерий для определения оптимального размера пор носителя для адсорбци­онной иммобилизации ферментов был предложен Р. Мессингом (1976), который изучал адсорбцию различных ферментов на по­ристом стекле и керамических носителях с калиброванным размером пор. В соответствии с этим критерием диаметр пор должен приблизительно в два раза превосходить размер мо­лекулы белка в направлении ее максимального удлинения- При этом предполагается, что молекулярные размеры субстрата на­много меньше, чем фермента, так что молекула субстрата за­ведомо способна проникнуть в пору, где находится сорбнрован-

49

ный фермент. В том случае, если субстратом является вещество с очень большой молекулярной массой, выбор диаметра пор носителя может диктоваться уже размерами молекулы субстрата. Более того, высокомолекулярный субстрат сам может служить носителем для иммобилизации фермента. Например, для адсорб­ционной иммобилизации ферментов целлюлазного комплекса был успешно использован его субстрат — целлюлоза.

Значение рН. Реакция среды оказывает очень сильное влия­ние на эффективность сорбции фермента на поверхности носи­теля, особенно, если сорбция осуществляется главным образом за счет электростатических нааимодейстннй. Причина этого влияния состоит в том, что при изменении рН меняется состоя­ние ионизации ионогенных групп носителя и белка, ответствен­ных за связывание. Прн использовании носителей, не являю­щихся ионообмеЕшиками, максимальная адсорбция обычно дости­гается в нзоэлектрнческой точке белка. Иными словами, рН-за­висимость адсорбции должна иметь вид кривой с одним макси­мумом, соответствующим значению изоэлектрической точки. Од­нако известны случаи, когда это правило нарушается. Напри* мер, рН-зависнмость эффективности адсорбции альбумина на ла­тексе имеет вид W-образной кривой, а значение рН, при кото­ром достигается максимальная адсорбция этого белка на угле, изменяется от 3 до 6 в зависимости от типа последнего.

Ионная сила. Значение этой величины оказывает влияние на прочность связывания фермента с носителем. При высокой концентрации солей присутствующие в растворе ионы вытесняют с поверхности носителя связанные за счет электростатических взаимодействий белковые молекулы. Иными словами» возраста­ ние конной силы вызывает десорбцию фермента. Однако иногда эта закономерность не действует, и увеличение концентрации соли, наоборот, способствует адсорбции фермента на носителе. В таких случаях принято говорить об эффекте «высаливания» белка из раствора. ч-

Коицентрация фермента. При возрастании концентрации фермента в растворе, из которого происходит адсорбция, коли­чество сорбировавшегося на носителе фермента увеличивается и соответственно растет удельная каталитическая активность иммобилизованного препарата. Зависимость удельной каталити­ческой активности от исходной концентрации фермента, как пра­вило, имеет вид кривой с насыщением, что свидетельствует о существовании лишь ограниченного числа центров связывания фермента и а поверхности носителя, которые к тому же обла­дают неодинаковым сродством по отношению к белку. При дальнейшем повышении концентрации фермента в растворе мо­жет происходить образонание поверх первого слоя адсорбиро­ванного фермента второго и последующих слоев- Наибольшей каталитической активностью обладают верхние слои адсорбиро­ванного фермента, где ограничения, накладываемые на скорость реакции диффузией субстрата, минимальны. Поэтому излишняя

50

ггрузка» носителя ферментом приводит к тому, что более глубоко расположенные слои адсорбированного биокатализатора исключаются из сферы реакции, и в результате общая эффек­тивность использования фермента снижается.

Температура. Повышение температуры оказывает двоякое воздействие на процесс адсорбционной иммобилизации. С одной стороны, сильное нагревание приводит к потере ферментативной активности вследствие тепловой денатурации белковой глобулы. С другой стороны, рост температуры обычно обеспечивает уско­рение процесса благодаря повышению скорости диффузии мо­лекул фермента в порах носителя. Следовательно, должна су­ществовать некоторая оптимальная температура для проведе­ния адсорбционной иммобилизации. Точное значение оптималь­ной температуры зависит от природы адсорбируемого фермента и поверхности носителя.

Таким образом, эффективность адсорбционной иммобилиза­ции ферментов определяется тонким балансом целого ряда фак­торов. Нарушение этого баланса вследствие изменения (порой незначительного) какого-либо из внешних условий может при­вести к резкому ослаблению взаимодействия фермента с носи­телем и, следовательно, к его десорбции. Чтобы избежать этого нежелательного явления, на практике используется ряд методи­ческих приемов, некоторые «з которых рассмотрены в следую­щем разделе.