Интерпретация результатов исследования уровня свободных аминокислот крови

Продолжение таблицы

Органические кислоты

Моча: минимум 10 мл произвольно взятой (утренней) мочи; законсервировать с помощью двух-трёх капель хлороформа. Пробу следует срочно направить в лабораторию при температуре окружающей среды.

Плазма, ЦСЖ, стекловидная жидкость (лишь ограниченные, специфические показания): минимум 1 мл; тотчас заморозить и направить в лабораторию в сухом льду.

Анализ органических кислот в моче с помощью газовой хроматографии /масс-спектроскопии (GC-MS) предоставляет информацию о большом разнообразии метаболических путей и поэтому является одним из основных методов для проведения селективного метаболического скрининга. Помимо классических органических ацидурий он является важной составной частью диагностического обследования пациентов с подозрением на аминоацидопатии, дефекты окисления жирных кислот или нарушения митохондриального энергетического метаболизма. Анализ органической кислоты должен выполняться у любого ребенка с клиническими признаками общей интоксикации, невыясненным метаболическим кризом или лабораторными данными за нарушение промежуточного метаболизма, такими как метаболичский ацидоз, повышенный уровень лактата, высокая анионная разница, гипогликемия, кетонемия, неонатальная кетонурия или гипераммониемия. Помимо этого, уровень органических кислот в моче должен анализироваться у детей с невыясненной гепатопатией или неврологическими или нервно-мышечными симптомами, включая эпилептическую энцефалопатию, и у детей с очевидными полиорганными нарушениями, особенно при прогрессировании или вариабельности симптомов.

Органические кислоты лучше всего исследовать в моче, так как они обычно экскретируются почками и имеют гораздо более высокие концентрации в моче, чем в других биологических жидкостях. Тем не менее в исключительных случаях некоторых нарушений или для контроля над лечением полезным может быть точное количественное определение содержания специфических органических кислот в плазме или в ЦСЖ с помощью анализов с ипользованием изотопной дилюции. К числу примеров относятся глутаровая ациурия I типа (глутаровая кислота и 3-гидроксиглутаровая кислота), дефекты кобаламина (метилмалоновая кислота), тирозинемия I типа (сукцинилацетон) и различные церебральные формы органических ацидурий, такие как недостаточность сукцинатполуальдегид дегидрогеназы (SSADH) (4-гидроксимасляная кислота) и болезнь Канавана (N-ацетиласпарагиновая кислота). Анализы с использованием изотопной дилюции представляют собой метод выбора для постановки пренатального диагноза. При проведении патологоанатомических исследований мочу следует брать с помощью пункции или промывания мочевого пузыря; анализ органических кислот в плазме, в ЦСЖ или в стекловидной жидкости содержит гораздо меньшую информацию.

Ацилкарнитиновый профиль

Проба: 3-6 высушенных на фильтровальной бумаге пятен крови (карта Гатри)

Анализ диапазона значений ацилкарнитина с помощью тандемной масс-спектроcкопии (MS-MS) на высушенных на бумаге пятнах крови или бомбардировкой с помощью быстрых атомов /масс-спектроскопии (FAB-MS) позволяет осуществить постановку точного диагноза большинства органических ацидурий и дефектов окисления жирных кислот и все больше и больше используется при проведении неонатальных скринингов в Северной Америке и в Европе. Кроме того, его можно использовать в качестве первичного вспомогательного исследования у детей с острыми метаболическими кризами или гипогликемией, поскольку он является более быстрым, чем обычный анализ органических кислот при диагностике классических органических ацидурий, и более надежно выявляет дефекты окисления жирных кислот. Кроме того, анализ концентрации многих, но не всех, важных аминокислот, а также оротовой кислоты, необходимый для определения при метаболическом кризе с невыясненной причиной, можно провести количественно одновременно с помощью того же метода. Определение количества общего и свободного карнитина с помощью тандемной масс-спектроcкопии (MS-MS) на высушенных на бумаге пятнах крови (карты Гатри) не является точным: их определение требует проведения особого анализа плазмы или сыворотки (уровня карнитина).

Уровень карнитина

Проба: 1 мл сыворотки / плазмы, ± 5 мл мочи; проба подлежит быстрой отправке в лабораторию при температуре окружающей среды.

Жирные с длинной углеродной цепью кислоты транспортируются в митохондрию в качестве сложных эфиров карнитина; это процесс, который требует трансэстерификации соединений ацил-СоА на внутренней и внешней сторонах внутренней мембраны митохондрии. Кроме того, соединения ацил-СоА, которые накапливаются в митохондрии, могут превращаться в сложные эфиры карнитина, удаляться из митохондрии и экскретироваться в мочу. Этот механизм детоксикации вызывает вторичное истощение запасов карнитина при большинстве нарушений, препятствующих метаболизму митохондриальных CoA-активированных карбоновых кислот, включая органические ацидурии, дефекты окисления жирных кислот и дефекты дыхательной цепи. При выявлении метаболического нарушения пониженные уровни карнитина в сыворотке могут расцениваться как симптом этих нарушений. Точное количественное определение общего, свободного и эстерифицированного карнитина в сыворотке или плазме (уровень карнитина) является обязательным при установлении факта недостаточности карнитина и при контроле за введением карнитина при этих нарушениях, а также недостаточности карнитинового переносчика.

Свободный карнитин почти полностью реабсорбируется в почечных канальцах, в то время как отфильтрованные соединения ацилкарнитина в основном экскретируются в мочу. Анализы карнитина в моче следует выполнять лишь в сочетании с анализами плазмы; они могут потребоваться в том случае, если уровни карнитина плазмы аномальны или при контроле за лечением. Повышенное содержание ацилкарнитинов в моче обычно наблюдается при органических ацидуриях и при дефектах окисления жирных кислот и, в сочетании с нормальными значениями карнитина в плазме, это является свидетельством хорошей детоксикационной способности. Высокие уровни свободного карнитина в моче и пониженный коэффициент реабсорбции в почечных канальцах (< 90%) могут служить признаком дисфункции почечных канальцев как причины истощения запасов карнитина в организме.

Длинноцепочечные карнитины

Проба: 1 мл сыворотки /плазмы; в том случае, если на месте анализ проб недоступен, во избежание липолиза их следует в сухом льду доставить в лабораторию.

При определении уровня карнитинов предполагается определение количественного уровня лишь сложных эфиров короткоцепочечных карнитинов; поэтому этот метод непригоден для определения количественного содержания метаболитов, накапливающихся при дефектах окисления жирных кислот с длинной углеродной цепью. Определение количественного содержания длинноцепочечных карнитинов имеет ограниченную практическую значимость, так как дефекты окисления длинноцепочечных жирных кислот с успехом распознаются с помощью анализа карнитинов, а введение определенной дозы карнитина можно контролировать путем анализа уровня свободного карнитина в плазме. Тем не менее, определение количественного содержания длинноцепочечных карнитиновых соединений может представлять интерес при лечении некоторых пациентов с дефектами окисления жирных кислот с длинной углеродной цепью.

Свободные жирные кислоты и кетоновые тела

Проба: 1 мл сыворотки /плазмы; во избежание липолиза пробы следует в сухом льду доставить в лабораторию.

Анализ свободных жирных кислот и кетоновых тел в плазме или в сыворотке дает важную инфорацию о катаболизме липидов и о кетогенезе; проведение анализа необходимо у всех пациентов с острой метаболической комой или гипогликемией. Помимо этого, он является единственным наиболее важным исследованием в конце теста на голодание (см. главу 11). Нормальные значения уровня свободных жирных кислот и кетоновых тел варьируют в зависимости от метаболического состояния. Высокие уровни инсулина после приема пищи препятствуют возникновению липоза, приводя к низким концентрациям как свободных жирных кислот (<300 мкмоль/л), так и кетонов (<100 мкмоль/л). В противоположность этому, активация липолиза при голодании приводит к непрерывному повышению уровней свободных жирных кислот вплоть до 2-3 ммоль/л в течение 24 часов, и к последовательному повышению уровня кетоновых тел до концентраций, которые превышают концентрации свободных жирных кислот. Интерпретация результатов на ранней стадии реакции на голодание может быть неоднозначной, так как уровень свободных жирных кислот может превысить концентрацию 1 ммоль/л до того, как наступит повышение уровня кетонов. Молярная концентрация кетонов меньшая, чем молярная концентрация свободных жирных кислот после 24 часов голодания, свидетельствует о нарушении окисления жирных кислот или о кетогенезе, тогда как молярная концентрация кетонов, на 50% меньшая, чем молярная концентрация свободных жирных кислот, фактически является диагностической для такого нарушения. Определение уровня свободных жирных кислот без учета кетонов является бесполезным.

Со средней и с длинной углеродной цепью жирных кислот

Проба: 1 мл сыворотки /плазмы; во избежание липолиза, пробу следует в сухом льду доставить в лабораторию.

С помощью методов газовой хроматографии / масс-спектроскопии (GC-MS) часть метаболических лабораторий может устанавливать различие между средней и длинной углеродной цепью жирных кислот (C6-C18) плазмы. Этот анализ позволяет получать информацию об окислении митохондриальных жирных кислот и о накоплении патологических метаболитов при дефектах окисления жирных кислот. Он является альтернативой ацилкарнитиновому анализу, при котором такая информация недоступна. Повышения уровня жирных кислот обычно отражают тип ацилкарнитинов, за исключением недостаточности карнитинпальмитоилтрансферазы I, при которой высокие уровни различных жирных кислот контрастируют с пониженными уровнями ацилкарнитинов. Кроме того, при дефектах окисления жирных кислот для контроля за лечением необходимо определять точное количественное содержание специфических химических соединений.

Оротовая кислота

Проба: минимум 10 мл мочи; консервируеться с помощью двух капель хлороформа. Проба подлежит незамедлительной отправке в лабораторию при температуре окружающей среды.

Синтез пиримидинов, главным промежуточным соединением которого является оротовая кислота, регулируется на уровне карбамилфосфатсинтетазы II (CPS II), которая катализирует первую реакцию в этом метаболическом пути. Митохондриальный изофермент CPS I катализирует продуцирование карбамилфосфата при детоксикации азота. Условия, при которых происходит накопление митохондриального карбамилфосфата, особенно при большинстве нарушений орнитинового цикла, способствуют также повышению уровней цитозолевого карбамилфосфата, биосинтеза пиримидинов и экскреции оротовой кислоты c мочой. Анализ содержания органических кислот может выявить это соединение, но для точного количественного определения необходимо применение методов высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) или масс-спектроскопии (МS). Анализ содержания оротовой кислоты в моче является одним из ургентных исследований при диагностировании недостаточности орнитинтранскарбамилазы (OTC) у детей с гипераммониемией. Скрытые повышения уровня оротовой кислоты при биосинтезе пиримидинов, как и у гетерозиготных носительниц при недостаточности орнитинтранскарбамилазы, можно распознать по повышенным концентрациям оротовой кислоты в моче после приема аллопуринола, который блокирует превращение оротовой кислоты в уридинмонофосфат. Повышенные концентрации оротовой кислоты можно также обнаружить при различных других генетических нарушениях, в том числе при митохондриальных нарушениях, синдроме Ретта и гиперурикемии (синдроме Леша-Нихана).

Пурины и пиримидины

Проба: минимум 10 мл мочи; желательна утренняя проба или суточный забор мочи

(хранить в холодном и защищенном от света месте). Консервируют пробу двумя каплями хлороформа; для диагностирования недостаточности аденилосукциназы, пробу отправляют в лабораторию при температуре окружающей среды или в сухом льду.

Анализ содержания пуринов и пиримидинов в моче с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) может указывать на наличие неврологических нарушений, особенно у пациентов с проблемами почечных канальцев. К числу других симптомов, которые могут быть следствием генетических нарушений метаболизма пуринов или пиримидинов, относятся артрит, мышечные судороги и мышечное истощение, анемия или иммунодефицит. Пищевой статус влияет на экскрецию пуринов и пиримидинов, уровень которых может значительно варьировать в течение суток: поэтому для анализа следует брать пробу суточной или утренней мочи. При заборе мочи и в предшествующий ему день следует избегать приема напитков и пищи, содержащих метилксантины, как, например кофе, черный чай, какао или лакрица. При наличии у пациента инфекции мочевыводящих путей, взятие пробы не допускается, так как бактерии заметно уменьшают концентрации пуринов или пиримидинов в моче. Пробу мочи, взятую для постановки диагноза неврологического заболевания, следует немедленно заморозить и доставить в лабораторию в сухом льду, так как сукциниламиноимидазол-карбоксамид-рибонуклеза (SAICAR), являющаяся маркерным метаболитом недостаточности аденилосукциназы, неустойчива при комнатной температуре. С помощью метода газовой хроматографии / масс-спектроскопии мочу следует исследовать на наличие в ней дигидропиримидинов, как и при анализе органических кислот, так как высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC) не в состоянии обнаружить эти вещества.

Исследования при нарушениях метаболизма галактозы

Пробы

Скрининг (на активность галактозы, галактозо-1-фосфат-уридилтрансферазы [GALT]): 3-6 высушенных на фильтровальной бумаге пятен крови отправляют в лабораторию.

Специфические анализы (на содержание галактозы, галактозо-1-фосфата, энзимологические исследования, мутационный анализ): 2 мл крови с консервантом ЭДТА, взятой предпочтительно через 30 минут после вскармливания молоком; отправляют в лабораторию при комнатной температуре, в случае необходимости (например, на протяжении недели) хранят при комнатной температуре (не охлаждают, так как можно вызвать гемолиз; не замораживают, так как киназа связана с мембраной).

Большинство врожденных нарушений метаболизма галактозы можно распознать путем определения концентраций галактозы и активности галактозо-1-фосфат-уридил-трансферазы в засушенных пятнах крови (карта Гатри), что является составной частью неонатального скрининга в большинстве западных стран. У детей с патологическими скрининг-тестами требуется проведение более точных анализов. Количественное определение содержания галактозы производится в плазме (нормальный уровень < 3 мг/дл), тогда как количественное определение содержания галактозо-1-фосфата проиводится в эритроцитах (нормальный уровень < 0,3 мг/дл).

Сахара

Проба: минимум 10 мл мочи; консервируют пробу двумя каплями хлороформа; пробу немедленно отправляют в лабораторию при температуре окружающей среды.

Для выявления патологической экскреции сахаров в моче при дефекте почечных канальцев и при диагностике некоторых нарушений метаболизма углеводов полезным может быть применение тонкослойной хроматографии. К числу сахаров, которые обычно подвергаются исселедованию, относятся глюкоза, галактоза, фруктоза и лактоза.

Гликозаминогликаны

Проба: минимум 10 мл мочи; пробу следует немедленно отправить в лабораторию при температуре окружающей среды.

Мукополисахаридозы (МПС) возникает вследствие дефекта метаболизма некоторых гликозаминогликанов (ГАГ), которые накапливаются в лизосомах и экскретируются с мочой. Их можно выявить с помощью количественного анализа концентрации общих гликозаминогликанов мочи (по отношению к уровню креатинина), но более точно их наличие диагностируется с помощью электрофоретического разделения различных фракций гликозаминогликанов. При мукополисахаридозах I, II, VI и VII типов наблюдается повышенный уровень дерматансульфата (связан с возникновением изменений в органах и скелете). При мукополисахаридозах I, II, III и VII типов наблюдается повышенный уровень гепарансульфата (связан с задержкой психического развиития), тогда как наличие кератансульфата (связан с возникновением изменений в скелете) является патогномоничным для мукополисахаридоза IV типа. При мукополисахаридозе VII типа и реже при МПС IV типа обычно наблюдается наличие хондроитинсульфата. Определение количественного содержания концентрации общих ГАГ в моче может дать пограничные или даже ложноотрицательные результаты, особенно у больных с МПС III (синдром Санфилиппо) и IV (синдром Моркио) типов. Электрофоретическое разделение ГАГ является методом выбора при подозрении на наличие данных нарушений.

Олигосахариды

Проба: минимум 10 мл мочи; в качестве консерванта добавляют две капли хлороформа; пробу немедленно отправяют в лабораторию при температуре окружающей среды.

Значительная часть лизосомных болезней накопления приводит к накоплению специфических олигосахаридов, которые можно выявить в моче. Они обычно распознаются путем разделения отдельных олигосахаридов с помощью метода тонкослойной хроматографии. Количественный анализ применим лишь для свободной нейраминовой кислоты (сиаловой кислоты) при постановке диагноза болезни накопления сиаловой кислоты (болезнь Саллы) Анализ олигосахаридов позволяет диагностировать следующие нарушения: фукозидоз, α-маннозидозы и β-маннозидозы, аспартилгликозаминурию, болезнь Шиндлера, сиалидоз, GM1- и GM2- ганглиозидозы, галактосиалидоз, болезнь Гоше, гликогеноз II типа (болезнь Помпе) и болезнь накопления сиаловой кислоты. Если клиническая картина у пациента наводит на мысль о наличии одного из этих нарушений, можно рекомендовать проведение энзимных исследований, несмотря на нормальные результаты анализа на содержание олигосахаридов в моче. Для диагностики других лизосомных болезней накопления, необходимо проведение только энзиматических исследований.

Маркеры пероксисомной функции

Пробы: 1 мл сыворотки / плазмы для исследования жирных кислот c очень длинной углеродной цепью; во избежание липолиза пробы следует доставлять в лабораторию в сухом льду, 1 мл крови с консервантом ЭДТА для анализа плазмалогенов в эритроцитах; пробу немедленно отправляют в лабораторию при температуре окружающей среды.

Большинство пероксисомных нарушений, особенно нарушений биогенеза пероксисом, вызывают недостаточное пероксисомное β-окисление. Определение жирных кислот с очень длинной углеродной цепью (VLCFA) в сыворотке или в плазме представляет собой исходный метод выбора при постановке диагноза таких нарушений (см. главу 27). Катамнестические исследования с целью точной биохимической характеристики некоторых пероксисомных нарушений включают в себя анализы желчных кислот, а также фитановой и пристановой кислот. Отдельный случай повышения уровня фитановой кислоты в сыворотке отмечен у взрослого пациента с болезнью Рефсума. Такие нарушения синтеза эфиров липидов, как точечная хондродисплазия тазобедренного или плечевого сустава или её разновидности, требуют количественного определения содержания плазмалогенов в эритроцитах.

Желчные кислоты

Проба: 5 мл мочи, 2 мл плазмы или 2 мл желчной жидкости; пробу следует доставить в лабораторию в сухом льду.

При различных пероксисомных нарушениях, а также при дефиците биосинтеза желчных кислот, могут происходить изменения концентрации желчных кислот. Проведение этих анализов требует количественного определения специфических метаболитов в различных биологических жидкостях методами бомбардировки с помощью быстрых атомов / масс-спектроскопии.

Исследования при врожденных нарушениях гликозилирования

Проба: 1 мл сыворотки; пробу немедленно отправляют в лабораторию при температуре окружающей среды.

Для превращения в функциональные гликопротеины, многие ферменты, транспортные и мембранные белки, гормоны и т.п. требуют гликозилирования в аппарате Гольджи или в эндоплазматической сети. В построение боковых цепей углеводов вовлечено более 30 различных ферментов; в лизосомах имеет место расщепление гликопротеинов.

Врожденные нарушения гликозилирования (ВНГ), описанные ранее как синдромы углевод-дефицитных гликопротеинов, являются результатом недостаточности ферментов, необходимых для гликозилирования белков. В качестве определенной группы, эти нарушения характеризуются расстройствами различных физиологических функций и широким спектром симптомов. Постановка диагноза и дифференциальная диагностика связаны с выявлением особенностей патологического гликозилирования при помощи изоэлектрофокусировки ферритина. Этот тест, будучи общим тестом на выявление пониженного гликозилирования трансферрина, не позволяет обнаружить все синдромы ВНГ. Вторичные расстройства гликозилирования могут быть результатом хронического алкоголизма, классической галактоземии или непереносимости фруктозы (недостаточный синтез маннозо-6-фосфата).

Стеролы

Проба: 1 мл сыворотки / плазмы; пробу отправляют в лабораторию в сухом льду.

Анализ стерола при помощи метода газовой хроматографии / масс-спектроскопии (GC-MS) требуется при диагностике нарушений метаболического пути биосинтеза периферического холестерина, особенно при синдроме Смита-Лемли-Опица.

Порфирины

Пробы: 20 мл мочи (произвольный отбор пробы, без консерванта), 5 мл фекалий, 5-10 мл гепаринизированной крови, без антикоагулянтов. Пробу хранят в холодном, защищенном от света месте, или немедленно отправляют в лабораторию при температуре окружающей среды.

Накопление специфических промежуточных метаболитов при порфириях вызывает абдоминальные, неврологические и дерматологические симптомы. Обычно количественное определение различных порфиринов и их предшественников производится в моче и/или в фекалиях. Цитозольные энзимологические исследования производятся в эритроцитах. Врожденная эритропоэтическая уропорфирия (болезнь Гюнтера) характеризуется типичным изменением цвета мочи (наличие коричневых и краснофлюоресцентных пятен на детских пеленках). При подозрении на наличие острой печеночной порфирии применяют специальные скрининг-тесты на наличие порфобилиногена в моче (проба Гёша, проба Ватсона-Швартца). Предпочтительным является количественное определение содержания порфобилиногенов и дельтааминолевуленовой кислоты.

Специфические исследования ликвора и мочи при нейрометаболических нарушениях

Пробы:

Пробы ликвора: Берут несколько проб (в возрасте менее 1 года: 0,5 мл (одна проба); для метаболических исследований применяют 2-4 пробы; в возрасте старше 1 года: 1 мл (одна проба), используют 3-5 проб). Немедленно замораживают пробы у постели больного (в сухом льду или в жидком азоте), хранят при температуре =-70⁰С. Анализ птеринов требует добавления ДТЭ и ДЭТАПАК в качестве антиоксидантов. При наличии в пробах крови, перед замораживанием их центрифугуют (необходимо поставить об этом в известность лабораторию!). Для проведения катамнестического анализа некоторые авторы настоятельно рекомендуют хранить две пробы ликвора (примерно 1 мл каждая) при температуре -70⁰С.

Птерины в моче: 10 мл произвольно взятой пробы мочи; хранят в холодном и защищенном от света месте; транспортируют в лабораторию в сухом льду. Параллельно, берут 5 мл мочи; добавляют 6 М раствор HCl (рН 1,0-1,5); добавляют 100 мг MnO2 и тщательно размешивают в течение 5 минут (при комнатной температуре). Центрифугируют 5 минут (4000 об/мин); отправляют супернатант экспресс-почтой в лабораторию, защитив его алюминиевой фольгой от попадания света.

При диагностическом обследовании больного с подозрением на нейрометаболическое нарушение, пункцию спинно-мозговой жидкости (СМЖ) следует выполнять лишь после проведения основных анализов крови и мочи и после тщательной оценки результатов нейроскопических исследований. Селективный скрининг на ЦСЖ не производится. Тем не менее, ряд нейрометаболических нарушений можно диагностировать лишь с помощью специфических исследований СМЖ, исследующих метаболические цепи церебрального метаболизма, особенно нейротрансмиттеров. При исследовании СМЖ, анализ должен включать в себя количественное определение уровня лактата, пирувата и аминокислот (выполняются с помощью методов, удобных для исследования СМЖ). Кроме того, анализ должен включать в себя количественное определение содержания клеток, глюкозы, белка, классов иммуноглобулинов, специфических иммуноглобулинов и оценку гематоэнцефалического барьера.

Надежные результаты специфических исследований СМЖ можно получить лишь в том случае, если строго придерживаться соответствующей процедуры. Процедура должна заблаговременно обсуждаться с нейрометаболической лабораторией. Анализы некоторых веществ (таких как птерины, серотонин и катехоламины) требуют добавления определенных реактивов. Количественно определить содержание свободной гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) можно в пробах, которые были быстро заморожены в сухом льду или в жидком азоте у постели больного. Отбор проб должен производиться в определенное время дня, в строгой последовательности в пробирки. Производится забор фиксированного количества СМЖ, так как многие метаболиты характеризуются суточными изменениями и каудокраниальным градиентом концентрации. И наконец, важным является точная маркировка проб СМЖ, которые отсылаются в лабораторию. Для диагностики недостаточности кофакторов тетрагидробиоптерина (BH4) у новорожденных с гиперфенилаланинемией, необходимо проведение анализа содержания птеринов в моче с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Анализ птеринов в СМЖ необходим при исследовании биогенных аминов.

Таблица 36