9.3. Жидкостная хроматография

Жидкостно-жидкостная хроматография по сути близка к газо-жидкостной. На твердый носитель так же наносится пленка жидкой фазы и через колонку, наполненную сорбентом, пропускают жидкий раствор. Этот вид хроматографии называют жидкостно-жидкостной распределительной хроматографией. Жидкость, нанесенную на носитель, называют неподвижной жидкой фазой, а растворитель, передвигающийся через носитель, – подвижной жидкой фазой. Жидкостно-жидкостная хроматография проводится в колонке (колоночный вариант) или на бумаге (бумажная хроматография).

Разделение смеси веществ в жидкостно-жидкостной хроматографии основывается на различии коэффициентов распределения вещества между несмешивающимися растворителями.

Широкое применение в жидкостно-жидкостной хроматографииполучили тройные системы, состоящие из двух несмешивающихся растворителей и третьего, растворимого в обеих фазах. Такие системы позволяют получать набор несмешивающихся фаз различной селективности. Хотя в качестве подвижной и неподвижной фаз выбираются растворители, не смешивающиеся между собой, все же во многих системах наблюдается некоторая взаимная растворимость. Чтобы предотвратить процессы взаимного растворения жидкостей в ходе хроматографирования, подвижную фазу предварительно насыщают неподвижной.

Для сохранения неизменного состава фаз применяют также метод химического закрепления неподвижной фазы на сорбенте. При этом используют взаимодействие растворителя с группами ОН^– на поверхности носителя. Адсорбенты с закрепленной на их поверхности жидкой фазой выпускаются промышленностью.

В жидкостной хроматографии чаще всего применяются колонки небольшой длины – от 3 до 25 см. Внутренний диаметр колонок колеблется от 1 до 4,6 мм. Эффективность колонки связана с вязкостью, коэффициентом диффузии и другими физическими свойствами жидкостей. Носитель неподвижной фазы должен обладать достаточно развитой поверхностью, быть химически инертным, прочно удерживать на своей поверхности жидкую фазу и не растворяться в применяемых растворителях. В качестве носителей используют вещества различной химической природы: гидрофильные носители (силикагель, целлюлоза и др.), гидрофобные носители (фторопласт, тефлон и другие полимеры).

Кроме обычных носителей, используемых для заполнения колонок, в распределительной хроматографии применяют специфический носитель (хроматографическую бумагу), а методика называется распределительная хроматография на бумаге, или распределительная бумажная хроматография.

Хроматографическая бумага должна быть химически чистой, нейтральной, инертной по отношению к компонентам раствора и подвижному растворителю и однородной по плотности. Имеют значение также такие свойства, как структура молекул целлюлозы в бумаге, сорбируемость, ориентация волокна и другие, влияющие на скорость движения растворителя характеристики процесса.

При выборе в качестве неподвижной фазы бумаги необходимо учитывать, что некоторые органические вещества превращают гидрофильную бумагу в гидрофобную. Для этого ее можно пропитать растворами различных гидрофобных веществ: парафина, растительного масла и др.

В выбранных растворителях компоненты пробы должны иметь разную растворимость, иначе разделения вообще не произойдет. В растворителе, являющемся подвижной фазой, растворимость каждого компонента должна быть меньшей, чем в растворителе неподвижной фазы, но все же составлять вполне заметное значение. Это ограничение связано с тем, что если растворимость вещества будет очень велика, вещество будет двигаться вместе с фронтом растворителя, а если растворимость будет мала, вещество останется на начальной линии.

Для разделения водорастворимых веществ в качестве подвижной фазы обычно выбирают органический растворитель, а в качестве неподвижной – воду. Растворители подвижной и неподвижной фаз не должны смешиваться, состав растворителя в процессе хроматографирования не должен изменяться, растворители должны легко удаляться с бумаги, быть доступными и нетоксичными для человека. Индивидуальные растворители в распределительной хроматографии используют относительно редко. Чаще для этой цели применяют смеси веществ, например, бутилового или амилового спирта с метиловым или этиловым, насыщенные водные растворы фенола, крезола, смеси бутилового спирта с уксусной кислотой, аммиаком т. д.

Качественный состав пробы при использовании метода бумажной распределительной хроматографии может быть установлен по специфической окраске отдельных пятен на хроматограмме либо по числовому значению коэффициента распределения каждого компонента.

Количественные определения в распределительной хроматографии выполняются по хроматографическим характеристикам (площадь пятна на хроматограмме и интенсивность его окраски) либо по методу вымывания. В последнем случае хроматограмму разрезают на отдельные части по числу пятен, каждое пятно обрабатывают соответствующим экстрагентом и определяют количество экстрагированного вещества любым подходящим методом (фотометрическим, полярографическим и т. д.).

Жидкостная хроматография высокого разрешения, или высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), является компьютеризированным методом, позволяющим определить активные вещества и их соотношение с точностью до миллионных долей.

Большое влияние на удерживание и селективность разделения в ВЭЖХ оказывает природа элюента. Для каждой разделяемой смеси помимо адсорбента надо выбрать определенный по природе и составу элюент, чтобы достигнуть оптимальной степени разделения: полного разделения за возможно короткое время.

Для выбранного сорбента (по геометрии зерен, пор и химии поверхности) от природы и состава элюента зависят все основные величины, определяющие степень разделения: селективность системы, адсорбент, элюент, факторы емкости анализируемых веществ, эффективность колонки. Природа элюента влияет на работу детектирую- щих систем.

Элюент для ВЭЖХ должен обеспечить достаточно высокую селективность за приемлемое время; быть маловязким, чтобы обеспечить небольшое сопротивление потоку и высокую эффективность; растворять анализируемые вещества; быть дешевым, доступным и безопасным в работе.

Элюент не должен химически реагировать ни с анализируемыми веществами, ни с адсорбентом, содержать сильносорбирующихся примесей, в частности, воду и другие полярные вещества при разделении на полярных адсорбентах, регистрироваться детектором.

В качестве элюентов применяют н-алканы (пентан, гексан, гептан) как в чистом виде, так и с добавками различных полярных веществ (метанол, этанол, изопропанол, простые и сложные эфиры, хлороформ и другие полярные вещества). Также используют водоспиртовые смеси, в некоторых случаях применяют и неводные смеси на основе ацетонитрила и тетрагидрофурана. В качестве элюентов в ВЭЖХ с ИК-спектрофотометром с Фурье-преобразованием применяют дейтерированные соединения (CD₃CN, D₂O).

В ВЭЖХ применяют адсорбенты разной геометрической структуры (с разной удельной поверхностью, разным диаметром пор, объемом пор и разным распределением пор по эффективным диаметрам). Для жидкостной адсорбционной хроматографии важна общая поверхность адсорбента. Однако как в газовой хроматографии, так и в жидкостной селективность при одной и той же удельной поверхности может зависеть от размеров пор адсорбента.

Для ВЭЖХ разработан и выпускается достаточно широкий ассортимент адсорбентов, более 50 фирм производят около 200 наименований. В качестве адсорбентов чаще всего используются силикагели – 75%, полимеры (полиметакрилаты, полистиролдивинилбензолы, полиэтиленгликоли, целлюлозы и др.) – 20%, пористые углеродные адсорбенты на основе графитированной сажи, оксид циркония, гидроапатиты – 4%, оксид алюминия – 1%, а также ионообменники, бентоны, адсорбенты со слоем жидких кристаллов и др.

Полимерные сорбенты применяются для разделения и определения сахаров в пище и напитках. Для аналитических и препаративных разделений пептидов и белков применяются такие гидрофильные полимерные материалы, как полидекстрины. В эксклюзионной хроматографии используют пористые полимеры с широкими порами. Эксклюзионная хроматография с органическими элюентами называется гель-проникающей хроматографией и применяется для разделения полимеров. Эксклюзионная хроматография с водными элюентами (гель-фильтрационная хроматография) используется для разделения биомолекул.

Современный жидкостный хроматографвключает в себя следующие системы и устройства: систему подготовки и подачи элюента, в которую входит резервуар для элюента и насос, систему ввода пробы, хроматографические колонки, термостаты колонок и детекторов, детекторы и сборники фракций. Кроме того, к нему может быть присоединен интегратор или ЭВМ.

В ВЭЖХ применяются десятки типов детектирующих систем как универсальных, так и селективных, которые должны обладать низким пределом детектирования, определяемым отношением уровня шума к чувствительности, широким линейным диапазоном, стабильностью показаний, малой инерционностью (постоянной во времени).

В аналитической практике наибольшее распространение имеют фотометрический, спектрофотометрический, флуоресцентный, рефракто- метрический, электрохимический, масс-спектрометрический детекторы. Выбор модели хроматографа определяется аналитической задачей. Выпускаются следующие жидкостные хроматографы: простые, универсальные, автоматизированные, препаративные, специальные для молекулярно-ситовой хроматографии, для ионной хроматографии, микроколоночные и капиллярные, хроматографы на чипах.

Разновидностью жидкостной хроматографии, основанной на обмене ионов раствора на ионы твердой фазы, является ионообменная хроматография с кондуктометрическим детектированием. Метод ши- роко используется для решения биохимических проблем в научных исследованиях. В практических целях ионообменную хроматографию применяют для анализа аминокислот. В настоящее время с этой целью используются автоматический аминокислотный анализатор, который позволяет проводить анализ смеси аминокислот белковых гидролизатов.

Метод тонкослойной (планарной) хроматографии (ТСХ), получивший в настоящее время широкое распространение, был разработан Н. А. Измайловым и М. С. Шрайбер в 1938 г.

Метод ТСХ – простой, дешевый, оперативный метод хроматографии для анализа всех классов соединений. В методе ТСХ неподвижная твердая фаза тонким слоем наносится на пластинку. В 2–3 см от края пластинки на стартовую линию наносят пробу анализируемой жидкости и край пластинки погружают в растворитель, который действует как подвижная фаза жидкостной адсорбционной хроматографии. Под действием капиллярных сил растворитель движется вдоль слоя сорбента и с разной скоростью переносит компоненты смеси, что приводит к их разделению. Диффузия в тонком слое происходит в продольном и поперечном направлениях, поэтому процесс следует рассматривать как двумерный.

Для разделения используются стеклянные, металлические, пористые керамические и пластмассовые пластины размером 100  100 мм и другие пластины с однородным слоем адсорбента толщиной 50–300 мкм. Фракция зерен адсорбента может быть в пределах 3–15 мкм. Применяют стеклянные пластинки, на поверхности которых спекают слои адсорбента (такие пластины можно использовать повторно), а также пластины на основе стекловолокна (Instant thin-layer chromatography).

Основными адсорбентами для пластин в ТСХ являются силикагель, оксид алюминия, микрокристаллическая целлюлоза, триацетат целлюлозы для разделения комплексов металлов, а также неорганические ионообменники, хитозан. Для препаративной хроматографии используют пластины с изменяющейся толщиной адсорбционного слоя. По адсорбционной активности пластины подразделяются на полярные, неполярные и средней полярности. К некоторым пластинам для повышения чувствительности детектирования добавляются флуо- ресцирующие вещества (флуоресцеин, пирен и др.).

Кроме пластин в ТСХ для разделения используются стержни (150  0,9 мм) из стали, меди или кварца. После разделения смеси и высушивания стержни с постоянной скоростью пропускаются через пламя ионизационно-пламенного детектора. Эти стержни можно использовать многократно (до 100 раз).

Качественный анализ в ТСХ. Наиболее общий подход к качественному анализу основан на значениях подвижности. Хроматографическая подвижность является чувствительной характеристикой ве- щества, однако она существенно зависит от условий определения. При соблюдении стандартных условий получаются воспроизводимые значения подвижности, которые можно использовать в аналитических целях при сравнении с табличными, если они получены в тех же условиях опыта.

Самым надежным является метод свидетелей, когда на стартовую линию рядом с пробой наносятся индивидуальные вещества, соответствующие предполагаемым компонентам смеси. На практике стандартное вещество (свидетель) в том же растворителе наносится на стартовую линию вместе с анализируемой пробой и хроматографируется в тех же условиях.

Количественный анализ в ТСХ. Количественные определения в ТСХ могут быть сделаны непосредственно на пластинке либо после удаления вещества с пластинки. При непосредственном определении на пластинке измеряют тем или иным методом площадь пятна (например, с помощью миллиметровой кальки) и по заранее построенному градуировочному графику находят количество вещества.

Наиболее точным считается метод, в котором вещество после разделения удаляется с пластинки и анализируется спектрофотометрическим или иным методом. Удаление вещества с пластинки обычно производят механическим путем, хотя иногда применяют вымывание подходящим растворителем.

К основным преимуществам ТСХ относятся: одновременное разделение нескольких проб (до 20 и более), возможность двумерного разделения, возможность наблюдать весь процесс разделения, высокая производительность; полный анализ (на старте можно проверить остатки пробы), быстрота разделения; низкая стоимость, небольшое количество элюента, возможность широкого выбора цветных реакций, возможность применения селективных и специифических детекторов.

Недостатками ТСХявляется то, что пластины в ТСХ – открытые системы, поэтому некоторые неустойчивые соединения (чувствительные к кислороду, влаге и т. п.) могут разлагаться; в простейших вариантах ТСХ затруднен количественный анализ, и в этих случаях можно говорить о полуколичественном методе; по эффективности разделения метод ТСХ значительно уступает высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Исторически в ТСХ количественное измерение проводили посредством визуальных наблюдений. В последние годы созданы совершенные, но дорогие детектирующие системы: денситометрия, масс-спектрометрия для ТСХ, радиосканирование изотопов, ТСХ-ИКС, лазерное сканирование для флуоресцентных измерений. Сканирование пятен с помощью УФ-сканеров позволяет детектировать на уровне нанограмм. Флуоресцентные сканеры позволяют достичь предела детектирования в наиболее благоприятных случаях пикограммового уровня.

Метод ТСХ используют центры Госсанэпидемнадзора, центрыстандартизации и метрологии, экологические центры, аналитические лаборатории по контролю качества пищевых продуктов, лаборатории станций защиты растений, ветеринарные лаборатории, лаборатории агрохимслужбы и т. д.

При анализе пищевых продуктов с помощью вышеперечисленных методов могут быть решены следующие задачи:

·определение химической природы веществ, обуславливающих характерный аромат свежих продуктов;

·контроль за состоянием продуктов в процессе обработки и хранения;

·объективная оценка показателей, характеризующих качество исходного сырья и готовых изделий из него;

·установление и устранение причин, вызывающих нежелательные изменения продуктов в процессе их изготовления;

·установление факта фальсификации продукта и др.

Методами ГХ и ВЭЖХ идентифицируют и определяют летучие вещества, участвующие в формировании вкуса и аромата многих пищевых продуктов или отвечающих за их порчу. Например, определяют летучие жирные кислоты, характерные для качественного мяса, или кислоты, образующиеся при изменении нормального процесса брожения квашеной капусты и обуславливающие посторонние оттенки ее запаха. Методы используются для определения никотина, нитрозамина (в рыбе и копченостях), пищевых добавок (красители, консерванты, антиокислители), загрязнителей окружающей среды (пестициды, афлатоксины, остатки лекарственных препаратов, витамины) и др.

Весьма ценными являются методы ГХ и ВЭЖХ в установлении фактов фальсификации потребительских товаров. Так, желтый краситель в макаронных изделиях может создать впечатление о высокой стоимости продукта. Наличие такого красителя можно подтвердить методом ВЭЖХ. Определение антоцианов и гликозидов, отвечающих за цвет вина, позволяет выявить натуральность вина. Подделки коньяка также можно распознать с помощью ГХ.

Методом ВЭЖХ идентифицируют и определяют небелковый азот, например, мочевину, которую добавляют при фальсификации белковых продуктов с целью увеличения азотистых веществ. Обнаружение аминокислоты оксипролина, присутствующей, главным образом, в белках соединительной ткани, т. е. в дешевом сырье, позволяет выявить факт замены полноценного белка мяса. Жиры, определяемые по триглицеридному составу методом ГХ, могут дать информацию о количестве жира и добавках постороннего жира. По определению жирно-кислотного состава можно сделать вывод о замене какао-масла гидрожиром в шоколаде и т. п.

В настоящее время некоторые виды хроматографии используют не как самостоятельные методы анализа, а как методы предварительного исследования или как методы подготовки пробы к последующему определению другими методами, в том числе хроматографическими.

Так, при определении аминокислот в гидролизате белков мяса или крови методом биологической химии проводят предварительную очистку гидролизата на колонках с ионитами. Аналогично поступают при определении летучих оснований и свободных жирных кислот в мясе и рыбе.

Методом ТСХ устанавливают наличие в исследуемом образце хлорорганических пестицидов, количественное определение которых затем проводят методом ГЖХ.