Физико-химические свойства белков

Белки представляют собой макромолекулы, содержащие большое количество кислых и оснóвных функциональных групп. Кислые свойства белка определяются, главным образом, присутствием карбоксильных групп дикарбоновых аминокислот, а также фенольных, гидроксильных и сульфгидрильных групп. Аминные, гуанидиновые и имино-группы аминокислот придают белкам оснóвные свойства. На кислотно-щелочные свойства белка, в целом, влияет также характер соединения остатков аминокислот в белковой молекуле. Обладая одновременно кислотными и оснóвными свойствами, белки образуют биполярные ионы. Важнейшим фактором, определяющим поведение белка как аниона или катиона, является концентрация водородных ионов. Снижение рН среды уменьшает кислотную диссоциацию белка и переводит его в катион и, наоборот, повышение рН понижает щелочную диссоциацию и переводит белковые частицы в анионы.

При определенном значении рН (неодинаковом для различных белков) кислотная и щелочная диссоциации уравниваются, в результате суммарный заряд белка в целом может стать равным практически нулю. В этих условиях молекула белка находится в изоэлектрическом состоянии и утрачивает способность перемещаться в электрическом поле. Значение рН раствора, при котором молекула белка находится в изоэлектрическом состоянии, называется изоэлектрической точкой белка. При этом значении рН белок существует в виде амфотерных ионов, несущих равные положительный и отрицательный заряды. Для большинства белков изоэлектрическая точка близка к нейтральному значению рН среды, но несколько сдвинута в кислую сторону. Это объясняется тем, что кислотные свойства у них преобладают над щелочными и в нейтральном растворе они реагируют как слабые кислоты. Молекулы таких белков содержат больше дикарбоновых аминокислот, чем положительно заряженных. Некоторые белки, наоборот, относительно богаче оснóвными аминокислотами, поэтому при нейтральном рН они ведут себя как слабые основания. Такие белки (например, гистоны и протамины) имеют изоэлектрическую точку в слабощелочном растворе.

Растворы белков в изоэлектрической точке наименее устойчивы. В этом случае сила отталкивания одноименно заряженных групп, повышающая устойчивость белкового раствора, уменьшается, и в качестве основного фактора стабилизирующего раствор белка выступает лишь гидратная оболочка биополимера. При этом возрастает спонтанная преципитация белковых молекул, понижающая его растворимость. В таких условиях белки, обладающие гидрофобными свойствами (например, казеин) т.е. не имеющие водной оболочки, выпадают в осадок даже без дополнительных воздействий.

Денатурация

Денатурацией называют существенное изменение вторичной и третичной структуры белка, связанное с нарушением, разупорядочиванием нековалентных взаимодействий без разрушения ковалентных связей. Данный процесс наблюдается при воздействии различных физических (нагревание) и химических (кислоты, ионы тяжелых металлов, спирты и т.д.) факторов на растворы белков. При этом белки часто переходят в нерастворимое состояние вследствие аггрегации молекул. В ряде случаев такие изменения являются обратимыми, и при прекращении воздействия молекулы белка возвращаются в свое исходное состояние. При этом растворимость белков восстанавливается. Такой процесс носит название ренатурации белка.

Тепловая денатурация

Почти все белки денатурируют при нагревании (исключением является, например, желатин). Этот процесс носит необратимый характер. Температура денатурации для разных белков различна. Присутствие солей и концентрация водородных ионов играют важную роль в тепловой денатурации белков. Наиболее быстрая коагуляция наблюдается в изоэлектрической точке (для большинства белков это слабокислый раствор). В нейтральных и сильнокислых растворах осаждение таких белков происходит значительно хуже, а при высоком рН вовсе не наблюдается (исключение – оснóвные белки). Добавление к раствору белка нейтральных солей облегчает и ускоряет коагуляцию белков при нагревании вследствие дегидратирования белковых молекул.

Осаждение белков

В растворе молекулы белка вступают во взаимодействие со многими соединениями (кислотами, ионами металлов, спиртами и т.д.), а также конкурируют с ними и друг с другом за молекулы растворителя (воды). Во многих случаях результатом этих процессов является выпадение белков в осадок. Осадки белков можно получить путем обратимого или необратимого осаждения, изменяя параметры факторов, стабилизирующих молекулы белка (температуру, заряд молекулы, величину гидратной оболочки и др.).

Концентрированные минеральные кислоты (кроме H₃PO₄) вызывают необратимое осаждение белков из растворов, что связано как с дегидратацией белковых молекул, так и с денатурацией белка. Избыток минеральной кислоты, за исключением азотной, растворяет выпавший осадок белка, полностью разрушая, «сжигая» белок. Поэтому за осаждением белка при использовании HCl и H₂SO₄ наблюдают на границе раздела фаз между белковым раствором и кислотой, где химическое воздействие последней минимально. Азотная кислота не разрушает белки, а модифицирует их, поэтому при ее избытке осадок сохраняется и приобретает характерный для нитросоединений желтый цвет.

Белки из растворов могут осаждаться органическими кислотами, однако разные органические кислоты неодинаково действуют на белок. Трихлоруксусная (ТХУ) и сульфосалициловая кислоты являются очень чувствительными и специфическими реагентами на белок и, поэтому, находят широкое применение в биохимических лабораториях. ТХУ часто применяется для полного удаления белков из биологических жидкостей (например, из сыворотки крови). При этом продукты их распада остаются в растворе. Это особенно важно в тех случаях, когда нужно отдельно определить азот белка и азот низкомолекулярных соединений: аминокислот, мочевины и др. (так называемый «небелковый азот»). После осаждения белка ТХУ легко удаляется из фильтрата при кипячении, поскольку она разлагается с образованием летучих соединений – хлороформа и угольного ангидрида.

Многие органические растворители осаждают белки из нейтрального или слабокислого раствора. При добавлении к водному раствору белка определенной концентрации спирта или ацетона (осаждающие концентрации растворителей различны для разных белков) происходит выпадение белка в осадок. Осаждающее действие этих растворителей определяется дегидратацией молекул белка, что ведет к снижению их устойчивости в растворе. Если процесс осаждения проводить на холоду и полученный осадок быстро отделить от растворителя, то белок может быть снова переведен в раствор в водной фазе. Осаждение белков происходит при использовании некоторых других органических растворителей, например, фенола или формалина. Действие последних вызывает денатурацию белка вследствие дестабилизации водородных связей в молекуле полипептида.

Соли тяжелых металлов (Hg⁺², Ag⁺, Cu⁺², Pb⁺² и др.) вызывают необратимое осаждение белков за счет образования с ними нерастворимых в воде комплексов. В этом случае восстановление исходных свойств белков невозможно даже после удаления солей диализом или в результате сильного разбавления системы водой. Поэтому белки часто применяют в качестве противоядия при отравлении, например, солями ртути (сулема). Тем не менее, некоторые из таких осадков (при действии солей меди, свинца, цинка) растворяются в избытке осадителя вследствие адсорбции ионов металлов на поверхности белковых частиц: в результате этого белковые молекулы приобретают заряд и вновь переходят в раствор. Растворение осадков денатурированных белков при избытке солей тяжелых металлов называется адсорбционной пептизацией.

Растворы белков могут образовывать осадки при добавлении, так называемых алкалоидных реагентов. К последним относят таннин, пикриновую кислоту, некоторые другие вещества. Они представляют собой азотистые основания, содержащие различные гетероциклы с атомами азота. Способность белков осаждаться алкалоидными реагентами объясняется наличием сходных азотистых группировок в белках (имидазольные, пирролидиновые и др.) и в алкалоидах. Механизм осаждения белков алкалоидами заключается в образовании нерастворимых солеобразных соединений с оснóвными азотистыми группами. В таких комплексах белок выступает в роли катиона, алкалоид – аниона. Поэтому осаждение белков алкалоидами проводят в кислой среде (в этом случае молекулы белка перезаряжаются и переходят в состояние катионов). В щелочной среде осадки растворяются. Протамины и гистоны осаждаются в нейтральной среде.

Высаливание белков

Процесс высаливания основан на способности ионов солей связываться с коллоидными частицами белка и нейтрализовывать их заряд. Из-за различий в зарядах и размерах разные белки осаждаются разными концентрациями солей. Например, глобулины имеют большую молекулярную массу и осаждаются 50% (NH₄)₂SO₄, а альбумины – 100% (NH₄)₂SO₄ (см. ход работы). Сульфат аммония обладает резко выраженной высаливающей способностью и осаждает белки как в нейтральной, так и в слабокислой среде. Другие соли, например, хлорид натрия или сульфат магния, вызывают полное осаждение белков только при подкислении раствора. Высаливание белков является обратимым процессом. При уменьшении концентрации соли в растворе (например, при прибавлении воды) происходит растворение выпавшего осадка белка.

Контрольные вопросы

1. Системы классификации белков

2. Белки: основной принцип строения.

3. Функции белков

4. Уровни структурной организации белка. Надмолекулярные белковые комплексы

5. Физико-химические свойства белков. Денатурация, осаждение и высаливание белков

Литература

1. Овчинников Ю.А., Биоорганическая химия, «Просвещение», М., 1987

2. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В., Биохимия человека, т. 1, «Мир», М., 1993

3. Степанов В.М., Молекулярная биология: структура и функции белков, под ред. академика Спирина А.С., «Высшая школа», М., 1996

4. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д., Биологическая химия, «Высшая школа», М., 1998

5. Кольман Я., Рем К.-Г., Наглядная биохимия, «Мир», М., 2000

Ход работы

Тема: Физико-химические свойства белков