1.4.4 Инструментальные методы

Как видно из данных, приведенных в подразделах 4.1-4.3, для определения количественного содержания аскорбиновой кислоты применяются традиционные титриметрические методы. Несмотря на неоспоримые достоинства титриметрии, этот метод имеет ряд ограничений, к числу которых следует отнести: невозможность получения достоверного результата в присутствии других компонентов, входящих в состав лекарственного средства; высокая лабильность и способность к окислению. Поэтому все более широко применяются инструментальные методы анализа.

Разработан способ определения процентного содержания медицинской аскорбиновой кислоты в кристаллическом препарате, заключающийся в измерении светового потока, прошедшего через раствор и рассеянного раствором аскорбиновой кислоты, при этом раствор аскорбиновой кислоты нагревают, регистрируют экстремальное значение суммарного светового потока и температуру его наступления [14]. Устройство для реализации способа определения аскорбиновой кислоты представлено на рисунке 3.

Рисунок 3 - Устройство для определения содержания аскорбиновой кислоты

1 - источник света; 2 - измерительная ячейка; 3 - стеклянные окна; 4 - зеркала, 5 - фотоприемник; 6 - регистрирующий прибор; 7 - нагреватель; 8 - датчик температуры; 9 - регистрирующий прибор

На рисунке 4 показаны графики зависимости тока фотоприемника от температуры для определенной концентрации; рассеивающей способности раствора аскорбиновой кислоты (кривая 1), светового потока, прошедшего через среду (кривая 2), суммарного светового потока (кривая 3) [14].

Рисунок 4 - Зависимость тока фотоприемника от температуры для определенной концентрации аскорбиновой кислоты 1 - рассеивающая способность раствора аскорбиновой кислоты; 2 - световой поток, прошедший через среду; 3 - суммарного светового потока

Устройство работает следующим образом. Готовый раствор аскорбиновой кислоты загружают в измерительную ячейку 2 и нагревают с помощью нагревателя 7. Суммарный световой поток с помощью зеркал 4 попадает на фотоприемник 5 и регистрируется прибором 6. По мере увеличения температуры кристаллы аскорбиновой кислоты растворяются, световой поток, рассеянный средой (кривая 1, рис. 4), уменьшается, а световой поток, прошедший через среду (кривая 2, рис. 4), увеличивается. Наступает характерный момент, когда луч света, прошедший через среду, становится больше луча, рассеянного средой. Этому экстремальному значению суммарного светового потока соответствует определенное значение температуры раствора, которая измеряется датчиком температуры 8 и регистрируется прибором 9. Процентное содержание медицинской аскорбиновой кислоты определяется по формуле:

(2)

где Т_з - температура раствора, при которой зарегистрировано экстремальное значение суммарного светового потока, ^oС; m_в - масса воды, ч; m_н - масса навески кристаллического продукта, г; а, в - коэффициенты

Применительно к анализу аскорбиновой кислоты такой метод анализа как флуоресцентный характеризуется высокой специфичностью, позволяющей осуществлять оценку качества определяемого вещества в присутствии других компонентов и высокой чувствительностью [12].

При разработке методики использована известная реакция конденсации кислоты дегидроаскорбиновой с ОФДА:

На рисунке 5 показано, что спектр флуоресценции продукта конденсации КДА с ОФДА имеет характерный максимум при длине волны возбуждения 340 нм и длине волны регистрации 425 нм.

Рисунок 5 - Спектр флуоресценции продукта конденсации кислоты дегидроаскорбиновой с ОФДА при длине волны 340 нм

Таким образом, появление интенсивного излучения полученного хиноксалинового производного может быть положено в основу флуориметрической методики качественного и количественного анализа кислоты аскорбиновой в ЛС, ЛП и лекарственном растительном сырье.

Разработана флуориметрическая методика определения подлинности и количественного содержания кислоты аскорбиновой, основанная на ее окислении до кислоты дегидроаскорбиновой с последующей конденсацией с о-фенилендиамином. Установлено, что для ее проведения необходимо использовать в качестве окислителя меди ацетат, в качестве стабилизатора контрольного раствора - натрия эдетат, рН раствора должно находиться в пределах от 4 до 5. Измерять величину интенсивности излучения следует регистрировать при длине возбуждения 340 нм и длине волны регистрации 425 нм.

В основу количественного определения аскорбиновой кислоты положена флуориметрическая методика, для проведения которой измеряют величину флуоресценции при длине волны возбуждения 340 нм и длине волны регистрации 425 нм. С целью выявления линейной зависимости была построена графическая зависимость интенсивности флуоресценции хиноксалинового производного КА от первоначальной концентрации КА в растворе (рисунок 6) [12].

Рисунок 6 - Зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации кислоты аскорбиновой в растворе

Метрологические характеристики разработанной методики и методики, приводимой в фармакопее (титриметрической) приведены в таблице 1.

Таблица 1 - Данные для сравнительной метрологической оценки двух методик количественного анализа субстанции аскорбиновой кислоты

Предложено использовать метод высоко-эффективной жидкостной хроматографии для анализа водорастворимых витаминов, в том числе и аскорбиновой кислоты [9]. Установлено, что наилучшие результаты разделения водорастворимых витаминов удается достигнуть при градиентном элюировании. Подвижная фаза А - (0,6% фосфорная кислота) рН 1,5-1,8; подвижная фаза Б - ацетонитрил. При разделении аскорбиновой и никотиновой кислот более предпочтительнее использовать не подвижные фазы «Luna C18(2)» «Gemini C18». Подобранные условия использованы при определении витаминов в коммерческих образцах. Полученные результаты хорошо согласуются с паспортными данными.

Анализ учебной и специальной литературы, показал, что существует большое разнообразие методов анализа кислоты аскорбиновой.

Наиболее часто используемыми, для количественного определения кислоты аскорбиновой остаются различные титриметрические, спектрофотометрические, фотометрические и хроматографические методы.