9.5. Капиллярный электрофорез

Наряду с хроматографическими методами разделения в аналитическую практику, начиная с 1990 г., активно внедряется метод капиллярного электрофореза (КЭ).

Капиллярный электрофорез является альтернативой и дополнением к методу высокоэффективной жидкостной хроматографии, в первую очередь, для ионогенных и полярных соединений, воплотив в себе достоинства капиллярной газовой хроматографии, ВЭЖХ и традиционного электрофореза. Метод КЭ основан на разделении сложных смесей компонентов, находящихся в электролите, заполняющем квар- цевый капилляр, при приложении к нему разности потенциалов и прямого УФ-детектирования в потоке жидкости. Эффект разделения достигается за счет различия в электрофоретической подвижности ионов в присутствии электроосмотического потока.

Главными достоинствами метода КЭ являются выигрыш в эффективности, малый объем дозы, более простая процедура пробоподготовки, простое и дешевое аппаратурное оформление, возможность on-line детектирования и автоматизации, включая процедуру пробоподготовки. Высокая чувствительность лазер-индуцированного флуоресцентного детектирования в сочетании с различными приемами концентрирования пробы, так называемым стэкингом (stacking), позволяет использовать КЭ для анализа предельно малых количеств ве- щества (10^–16–10^–21 М). Стэкинг образца происходит, когда ионы аналитов пересекают границу, которая отделяет зону высокой проводимости раствора образца и низкой – ведущего электролита, – и применителен к заряженным и нейтральным аналитам. Использование стэкинга позволяет приблизить чувствительность метода КЭ к ВЭЖХ.

Дальнейший прогресс микросепарационной техники связан с обращением к микроэлектромеханическим системам. Это, в первую очередь, чип-приборы КЭ (одноканальные чип-сенсоры и многоканальные чип-линейки). Система, реализующая принципы электрофоретического разделения, включает кварцевый капилляр, источник высокого напряжения, устройство ввода пробы, детектор и систему вывода информации (рисунок 9.4).

Рисунок 9.4 – Устройство системы капиллярного электрофореза

Дополнительные устройства позволяют автоматизировать подачу образцов, осуществлять отвод тепла от капилляра, управлять прибором, собирать и обрабатывать полученные данные.

На границе раздела кварц-водного раствора электролита возникает двойной электрический слой. Распределение катионов между неподвижным и диффузным слоями, а следовательно, и толщина двойного слоя зависит от общей концентрации электролита в растворе: чем она больше, тем большая часть положительного заряда диффузного слоя перемещается в неподвижный слой и тем меньше толщина диффузного слоя. Микрообъем анализируемого раствора ( 2 нл) вводится в кварцевый капилляр, предварительно заполненный электролитом, обладающим буферными свойствами (ведущий электролит). После подачи высокого напряжения (до 30 кВ) к концам капилляра компоненты смеси начинают двигаться с разной скоростью, зависящей от их заряда и массы, достигая в разное время зоны детектирования.

При наложении продольного электрического поля в капилляре возникает движение носителей электрических зарядов во взаимно противоположных направлениях – электрофорез. Избыточная концентрация катионов в диффузной части двойного электрического слоя увлекает за собой всю массу жидкости в капилляре. Возникает течение жидкости в капилляре под действием электрического поля – электроосмотический поток (ЭОП), который осуществляет пассивный перенос раствора внутри капилляра. ЭОП характеризуется плоским профилем потока, который при движении зон компонентов внутри капилляра практически не вызывает их уширения. Этим и определяется очень высокая эффективность КЭ.

Метод капиллярного электрофореза может быть представлен в нескольких вариантах. Для аналитических целей используются следующие разновидности КЭ:

1. Зонный капиллярный электрофорез.

2. Мицеллярная электрокинетическая хроматография.

3. Капиллярный гель-электрофорез.

4. Изоэлектрическая фокусировка.

Наиболее распространенными вариантами капиллярного электрофореза являются зонный и мицеллярный.

Капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ), используемый в основном для разделения биополимеров (белков, полипептидов, нуклеотидов и т. д.), реализуется в капилляре, заполненном гелем (агарозой, целлюлозой, акриламидом и т. д.). На электрофоретическую подвижность биополимеров оказывает влияние характер пористости матрицы геля. Разделение молекул осуществляется по их размерам (так называемый «ситовый эффект»).

Компоненты смеси движутся в среде электролита с разными скоростями, образуя дискретные зоны. Катионные компоненты пробы, перемещаясь к катоду, обгоняют ЭОП и первыми регистрируются на электрофореграмме. Затем детектора достигает зона исходного раствора, в которой перемещаются нейтральные компоненты. Нейтральные соединения мигрируют с одинаковой скоростью, равной скорости ЭОП, и не могут быть разделены. В зависимости от их способности поглощать в УФ-излучении на электрофореграмме регистрируется пик, называемый системным. Для его идентификации в пробу часто добавляют специальные вещества – маркеры (ацетон, бензиловый спирт, оксид мезитила).

Поведение анионных компонентов пробы зависит от соотношения скоростей миграции электромагнитного потока и анионов. Если скорость электромиграции аниона меньше скорости ЭОП, он может быть зарегистрирован на той же электрофореграмме после системного пика. В противном случае анион выйдет из капилляра в прианодное пространство. Описанный вариант носит название капиллярного зонного электрофореза, в режиме которого могут определяться катионы и медленно мигрирующие анионы.

Мицеллярная электрокинетическая хроматография (МЭКХ)объединяет принципы электрофореза и хроматографии. Введенная в 1984 г. японским ученым Терабе МЭКХ получила наиболее широкое распространение среди других вариантов капиллярного электрофореза, в первую очередь, за счет способности разделять как ионогенные, так и незаряженные компоненты проб. Разделение нейтральных соединений стало возможным благодаря введению в состав ведущего электролита ПАВ – мицеллообразователей.

Компоненты пробы распределяются между фазой раствора и мицеллой, причем константа этого распределения специфична для каждого сорта молекул пробы. На электрофореграмме регистрируются нейтральные компоненты, а также медленно мигрирующие анионы пробы. В МЭКХ применяется новая техника концентрирования заряженных или нейтральных частиц – свипинг (sweeping), суть которой заключается в том, что аналиты концентрируются мицеллой, которая проникает в зону образца. При этом (в отличие от стэкинга) проводимость раствора образца близка проводимости ведущего электролита. Свипинг некоторых анионных аналитов дает высокие факторы концентрирования (в 1 000 раз) без какой-либо стадии предварительного концентрирования.

Для качественного и количественного анализа в КЭ используются два важнейших параметра: площадь (или высота) пика на электрофореграмме и время миграции. На точность определения площади (высоты) пика особенно влияет вводимый объем образца. Точность улучшается с повышением концентрации образца, особенно когда используется площадь, а не высота.

Важной областью применения капиллярного электрофореза (таблица 9.2) стала фармацевтика. Оценка чистоты лекарственных препаратов и хиральные разделения на 90% выполняются различными вариантами КЭ.

Таблица 9.2 – Использование различных вариантов КЭ для характеристики объектов биофармацевтики

Окончание таблицы 9.2

Развитие новых возможностей метода привело к расширению круга соединений и областей, доступных для анализа с использованием КЭ: криминалистика (анализ наркотиков), биомедицинские исследования, экологический мониторинг (анализ пестицидов, фунгицидов), анализ продовольственного сырья, пищевых продуктов, напитков (определение кофеина в растворимом кофе, ароматических альдегидов в винах); исследование и определение отдельных комплексных форм d-элементов в растворе.

В случае изотахофореза проба движется между двумя электролитами с различными подвижностями ионов. Как вариант вытеснительной хроматографии изотахофорез может быть использован на стадии предварительного концентрирования перед разделением методом КЭ.

В последние годы часто применяют капиллярный аффинный электрофорез и электрохроматографию. В последнем варианте воплощается техника высокоэффективного капиллярного электрофореза и высокоэффективной жидкостной хроматографии: разделение осуществляется в кварцевых капиллярах с внутренним диаметром 50–100 мкм, упакованных ультрасорбентом (диаметр частиц сорбента < 3 мкм). Течение элюента и перенос пробы происходит за счет электроосмотического потока.