9.1. Понятие, особенности и классификация хроматографии

Хроматография– процесс, основанный на многократном повторении актов сорбции и десорбции вещества при перемещении его в потоке подвижной фазы вдоль неподвижного сорбента.

Разделение сложных смесей хроматографическим способом основано на различной сорбируемости компонентов смеси. В процессе хроматографирования так называемая подвижная фаза (элюент), содержащая анализируемую пробу, перемещается через неподвижную фазу. Обычно неподвижная фаза представляет собой вещество с развитой поверхностью, а подвижная – поток газа или жидкости, фильтрующийся через слой сорбента. При этом происходит многократное повторение актов сорбции – десорбции, что является характерной особенностью хроматографического процесса и обуславливает эффективность хроматографического разделения.

Качественный хроматографический анализ, т. е. идентификация вещества по его хроматограмме, может быть выполнен сравнением хроматографических характеристик, чаще всего удерживаемого объема (т. е. объема подвижной фазы, пропущенной через колонку от начала ввода смеси до появления данного компонента на выходе из колонки), найденных при определенных условиях для компонентов анализируемой смеси и для эталона.

Количественный хроматографический анализ проводят обычно на хроматографе. Метод основан на измерении различных параметров хроматографического пика, зависящих от концентрации хроматографируемых веществ: высоты, ширины, площади и удерживаемого объема или произведения удерживаемого объема на высоту пика.

В количественной газовой хроматографии применяют методы абсолютной градуировки и внутренней нормализации, или нормировки. Используется также метод внутреннего стандарта.

Хроматография впервые была введена в аналитическую практику русским ботаником М. С. Цветом, который сформулировал закон адсорбционного замещения, заключающийся в следующем:

Вещества, растворенные в определенной жидкости, образуют определенный адсорбционный ряд А, В, С, …, выражающий относительное адсорбционное сродство его членов к адсорбенту. Каждый из членов адсорбционного ряда, обладая большим адсорбционным сродством, чем последующий, вытесняет его из соединения и в свою очередь вытесняется предыдущим.

Таким образом, основным условием для осуществления хроматографического процесса – процесса разделения веществ на колонке – М. С. Цвет считал различие в адсорбируемости.

В современной хроматографии для разделения веществ кроме молекулярной адсорбции используют и другие физико-химические явления. Имеется несколько классификаций метода, основанных на различных принципах.

В зависимости от выбранного типа подвижной и неподвижной фаз хроматография бывает:

 Газовая (газоадсорбционная и газожидкостная) – подвижная фаза-газ (аргон, азот, водород, гелий, воздух).

· Жидкостная – подвижная фаза-жидкость. Жидкостная хроматография подразделяется на жидкостно-жидкостную, жидкостно-адсор- бционную и жидкостно-гелевую.

Первое слово в этой классификации характеризует агрегатное состояние подвижной фазы.

В зависимости от механизма распределения веществ между подвижной и неподвижной фазами различают следующие виды хроматографии:

· Адсорбционная. Основана на различной способности отдельных веществ адсорбироваться на тех или иных адсорбентах.

· Распределительная. Основана на различной растворимости отдельных компонентов смеси в двух несмешивающихся жидкостях. Разделение обусловлено различием в растворимости разделяемых ве- ществ в неподвижной фазе (газовая хроматография) и различием в растворимости разделяемых веществ в подвижной и неподвижной жидких фазах.

· Ионообменная. Основана на различной способности разделяемых веществ к ионному обмену с тем или иным ионитом.

· Осадочная. Основана на образовании труднорастворимых осадков в определенном порядке, обусловленном их растворимостью.

· Аффинная. Основана на биоспецифическом взаимодействии компонентов с аффинным лигандом.

· Эксклюзивная. Основана на различии проницаемости молекул разделяемых веществ в неподвижную фазу. Компоненты элюируются в порядке уменьшения их молекулярной массы.

· Молекулярная. Обусловлена природой сил взаимодействия между неподвижной фазой и компонентами разделяемой смеси, т. е. межмолекулярными силами типа сил Ван-дер-Ваальса.

· Хемосорбционная. Включает кроме осадочной хроматографии комплексообразовательную (лигандообменную) и окислительно-восстано- вительную. Причиной сорбции являются соответствующие химические реакции.

· Адсорбционно-комплексообразовательная. Основана на образовании координационных соединений различной прочности в фазе или на поверхности адсорбента.

· Проникающая. Основана на различии в размерах или формах молекул разделяемых веществ, например, при применении молекулярных сит (цеолитов).

Следует учитывать, что очень часто процесс разделения включает несколько механизмов распределения.

По применяемой технике хроматографию следует делить следующим образом:

· Колоночная. Разделение веществ проводится в специальных колонках.

· Плоскостная (бумажная – разделение веществ проводится на специальной бумаге; тонкослойная – разделение веществ проводится в тонком слое сорбента).

В колоночной и тонкослойной хроматографии можно использовать любой из приведенных выше механизмов разделения, в бумажной хроматографии чаще всего применяют распределительный и ионообменный механизмы.

· Капиллярная.

· Хроматография в полях (электрических, магнитных и др.).

По способу относительного перемещения фазразличают:

· Фронтальный метод. Этот простейший по методике вариант хроматографии состоит в том, что через колонку с адсорбентом непрерывно пропускают анализируемую смесь, например, смесь компонентов А и В в растворителе. В растворе, вытекающем из колонки, определяют концентрацию каждого компонента и строят график в координатах «концентрация вещества – объем раствора, прошедшего через колонку». Эту зависимость обычно и называют хроматограммой, или выходной кривой.

Метод применяется, например, для очистки раствора от примесей, если они сорбируются существенно лучше, чем основной компонент, или для выделения из смеси наиболее слабо сорбирующегося вещества.

· Проявительный (элюентный) метод. При работе по этому методу в колонку вводят порцию анализируемой смеси, содержащей компоненты А и В в растворителе, и колонку непрерывно промывают газом-носителем или растворителем. При этом компоненты анализируе- мой смеси разделяются на зоны: хорошо сорбирующееся вещество В занимает верхнюю часть колонки, а менее сорбирующийся компонент А будет занимать нижнюю часть.

В газе или растворе, вытекающем из колонки, сначала появляется компонент А, далее – чистый растворитель, а затем компонент В. Чем больше концентрация компонента, тем выше пик и больше его площадь, что составляет основу количественного хроматографического анализа. Проявительный метод дает возможность разделять сложные смеси, он наиболее часто применяется в практике. Недостатком метода является уменьшение концентрации выходящих растворов за счет разбавления растворителем или газом-носителем.

· Вытеснительный метод. При использовании этого метода анализируемую смесь компонентов А и В в растворителе вводят в колонку и промывают раствором вещества D (вытеснитель), которое сорбируется лучше, чем любой из компонентов анализируемой смеси.

Концентрация раствора при хроматографировании не уменьшается в отличие от проявительного метода. Существенным недостатком вытеснительного метода является возможное наложение зоны одного вещества на зону другого, поскольку зоны компонентов в этом методе не разделены зоной растворителя.

В хроматографии чаще всего используют методику проявительного (элюентного) анализа. В этом случае наблюдаемый пик в координатах «концентрация – объем» называют хроматографическим пиком и характеризуют высотой, шириной и площадью.

Высота пика – это расстояние от максимума пика до его основания, измеренное параллельно оси отклика детектора. Ширина пика у основания – отрезок основания пика, отсекаемый двумя касательными, проведенными в точках перегибов восходящей и нисходящей ветвей хроматографического пика. Ширина пика на полувысоте – отсекаемый пиком отрезок линии, проведенной параллельно основанию пика на середине его высоты. Площадь пика – это площадь части хроматограммы, заключенной между пиком и его основанием.

Важным параметром пика является коэффициент асимметрии, который применяется для сравнения различных твердых носителей, адсорбентов и всей газовой системы хроматографа в целом. В идеальных условиях пик по форме близок к кривой Гаусса, т. е. симметричен. На практике пики по разным причинам в основном несимметричны.

Асимметрия пиков ухудшает разделение и затрудняет количественную обработку. Они появляются при разделении на неоднородных сор- бентах, когда концентрации анализируемых соединений соответствуют нелинейным участкам изотермы сорбции. Кроме того, это может быть вызвано в некоторых случаях кинетикой сорбции (замедленный процесс десорбции), наличием непродуваемых полостей. Асимметрию пиков оценивают относительно полуширин пиков на половине высоты (рисунок 9.1) отношением отрезка БВ к АБ либо на 1/10 высоты пика от основания отношением отрезков ДЕ к ГД. Результат будет точнее, если пользоваться отношением площадей половин пика (отношением заштрихованной части пика к незаштрихованной части).

Рисунок 9.1 – Оценка асимметричности пиков

В зависимости от цели проведения хроматографического процесса выделяют следующие типы хроматографии:

· Аналитическая. Предназначена для определения качественного и количественного состава исследуемой смеси.

· Неаналитическая. Применяется для исследования физико-хими- ческих характеристик веществ при использовании хроматографической аппаратуры и на основании параметров хроматографических зон.

· Препаративная. Применяется для выделения небольших количеств чистых компонентов (или смесей) в лабораторных условиях.

· Промышленная. Используется для получения чистых веществ в больших количествах.

Надежным способом исследования липидов, аминокислот, нуклеотидов, сахаров, витаминов, алкалоидов и других соединений является тонкослойная хроматография. Этот метод является наиболее простым, универсальным, высокочувствительным и быстро выполняется. Он позволяет наглядно и четко разделить ничтожно малое количество разделяемых веществ (от 0,1 до 0,005 мкг) и надежно их идентифицировать, что очень важно для анализа пищевых продуктов по показателям безопасности (содержание пестицидов, нитрозаминов, афлатоксинов).