48) Дробный метод исследования металлических ядов

Минерализация и ее виды

РАЗРУШЕНИЕ БИОЛ. М-ЛА ПЕРГИДРОЛЕМ И СЕРНОЙ КИСЛОТОЙ

Метод разрушения биол. м-ла пергидролем и серной кислотой в хим.-токс. анализе может быть использован при исследовании малых навесок объектов биол. происхождения, поступивших на исследование.

Выполнение минерализации. Исследуемый объект по возможности освобождают от воды выпариванием, измельчают и вносят в фарфоровую чашку, в которую небольшими порциями (при помешивании стеклянной палочкой) прибавляют пятикратное количество конц. серной кислоты и нагревают на водяной бане. При этом происходит обугливание исследуемого объекта с выделением оксида углерода (IV). После заметного уменьшения скорости выделения оксида углерода (IV) содержимое фарфоровой чашки количественно переносят в колбу Кьельдаля, которую устанавливают на асбестированную сетку. При слабом нагревании колбы в нее вносят небольшими порциями пергидроль. Прибавление новых небольших порций пергидроля производят до тех пор, пока жидкость не станет бесцветной или слегка желтоватой от наличия солей железа. После этого колбу с жидкостью охлаждают, а содержимое разбавляют десятикратным количеством воды.

Для удаления избытка пергидроля в колбу Кьельдаля небольшими порциями прибавляют насыщенный водный раствор сульфита натрия и кипятят в течение 5—10 мин. Вместо сульфита натрия для связывания избытка пергидроля можно прибавлять раствор сульфата гидразина. Минерализат, освобожденный от избытка пергидроля, используют для обнаружения «металлических ядов».

РАЗРУШЕНИЕ БИОЛ. М-ЛА АЗОТНОЙ И СЕРНОЙ КИСЛОТАМИ

Метод разрушения биол. м-ла азотной и серной кислотами является основным методом, применяемым в химико-токсикологических лабораториях нашей страны.

В начале минерализации конц. серная кислота играет роль водоотнимающего средства. Ее роль как водоотнимающего средства усиливается с повышением температуры. Благодаря водоотнимающему действию конц. серная кислота нарушает структуру клеток и тканей биол. м-ла. При повышении температуры (выше 110°С) и концентрации (до 60—70 %) серной кислоты она проявляет окислительные свойства и разлагается с выделением оксида серы (IV).

Азотная кислота, находящаяся в смеси с серной кислотой, вначале минерализации является слабым окислителем. Со временем часть азотной кислоты при окислении биол. м-ла превращается в оксиды азота и азотистую кислоту, которые являются автокатализаторами дальнейшего более интенсивного процесса окисления органических веществ азотной кислотой. С образованием оксидов азота и азотистой кислоты, а также с повышением температуры азотная кислота проявляет себя как сильный окислитель.

В процессе нагревания биол. м-ла со смесью азотной и серной кислот происходит не только разрушение органических веществ этими кислотами, но и ряд побочных реакций, к числу которых относятся реакции сульфирования и нитрования органических соединений. (фенильные группы аминокислот). Эти явления является нежелательным, так как нитро- и сульфосоединения довольно трудно разрушаются смесью этих кислот.

При разбавлении кислот водой степень нитрования и сульфирования значительно уменьшается. Поэтому разрушение биол. м-ла производится частично разбавленными азотной и серной кислотами.

В 1 стадии минерализации происходит деструкция биол. м-ла азотной и серной кислотами, которая заканчивается за 30—40 мин.В результате деструкции получается прозрачная жидкость (деструктат), имеющая желтоватую или бурую окраску.

2 стадии: происходит разрушение (окисление) органических веществ, находящихся в жидкой фазе (деструктате), полученной после деструкции биол. м-ла. Эта стадия разрушения более длительная, чем стадия деструкции.

Для окончательного разрушения органических веществ, находящихся в жидкой фазе, к ней при нагревании по каплям прибавляют азотную кислоту. Полное разрушение органических веществ в жидкой фазе зависит от количества прибавляемой азотной кислоты. От прибавления в колбу недостаточных количеств азотной кислоты находящиеся в ней органические вещества обугливаются горячей серной кислотой. При обугливании органических веществ серной кислотой из жидкости с выходящими газами могут улетучиваться соединения мышьяка и ртути.

Разрушение биол. м-ла азотной и серной кислотами считается законченным тогда, когда после прекращения добавления азотной кислоты (при нагревании колбы) будут выделяться белые пары серной кислоты и не будет происходить почернение минерализата.

Полученный минерализат используют для обнаружения и количественного определения «металлических ядов». минерализаты, полученные после разрушения биол. м-ла, подвергают денитрации (обнаружению и количественному определению катионов некоторых металлов мешают азотная и азотистая кислоты, а также оксиды азота)

РАЗРУШЕНИЕ БИОЛ. М-ЛА ХЛОРНОЙ, АЗОТНОЙ И СЕРНОЙ КИСЛОТАМИ

В хим.-токс. анализе в последнее время нашел применение метод разрушения биол. м-ла смесью хлорной (НClО 4 ), азотной и серной кислот, достигается почти полное разрушение биол. м-ла и в 2—3 раза сокращается время разрушения по сравнению со временем, необходимым для минерализации объектов биол. происхождения азотной и серной кислотами. После разрушения биол. м-ла с помощью хлорной, азотной и серной кислот получаются относительно небольшие объемы минерализатов, что повышает чувствительность этого метода. Недостаток метода: при использовании этого метода требуется особая предосторожность ввиду взрывоопасности хлорной кислоты.

Выполнение минерализации. В колбу Кьельдаля вносят тщательно измельченный биологический материал, прибавляют по 25 мл конц. азотной и серной кислот и 35 мл 37 %-го или 42 %-го раствора хлорной кислоты. постепенно усиливают нагревание колбы. При нагревании может происходить обугливание. В этом случае в колбу по каплям прибавляют концентрированную азотную кислоту. Окисление биол. м-ла продолжают прибавлением по каплям 35— 45 %-го раствора азотной кислоты. Когда жидкость в колбе станет прозрачной, тогда прекращают нагревание и проверяют полноту окисления органических веществ в минерализате: к капле охлажденного, разбавленного водой минерализата, прибавляют 25 %-й раствор аммиака. Появление слабо-желтой окраски свидетельствует об окончании процесса минерализации. Появление оранжевой окраски указывает на наличие в минерализате некоторых еще не разрушенных аминокислот (фенилаланин, тирозин, триптофан и др.).

Этот метод непригоден для разрушения биол. м-ла, подлежащего исследованию на наличие ртути, которая улетучивается в процессе минерализации.

СУХОЕ ОЗОЛЕНИЕ И СПЛАВЛЕНИЕ ОРГАНИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ

В литературе описан ряд способов минерализации органических веществ, основанных на нагревании исследуемых объектов до высокой температуры.

Метод сухого озоления основан на нагревании органических веществ до высокой температуры при доступе воздуха. Сухое озоление производят в фарфоровых, кварцевых или платиновых тиглях. на исследование берут относительно небольшие навески (1 —10 г) исследуемых объектов (пищевые продукты, биологический материал и др.) и нагревают их в тигле до 300—400 °С.

Недостатки: 1. улетучивание некоторых металлов или их соединений в процессе нагревания, а также взаимодействие отдельных металлов с материалом тиглей. При сухом озолении трудно контролировать температуру исследуемого м-ла непосредственно в тигле. при относительно невысокой температуре частично или полностью улетучиваются соединения ртути, таллия и др. При температуре выше 400 °С хлориды кадмия, свинца, серебра, цинка, марганца, мышьяка являются летучими. При несколько более высокой температуре могут улетучиваться некоторые соединения меди, никеля, хрома и др. при высокой температуре цинк, серебро, свинец и некоторые другие металлы могут взаимодействовать со стенками кварцевых и фарфоровых тиглей, а кобальт способен сплавляться со стенками платиновых тиглей или взаимодействовать с материалом фарфоровых тиглей.

Выполнение сухого озоления. Метод применяется тогда, когда имеется специальное задание исследовать объекты биол. происхождения на наличие марганца, меди и некоторых других металлов.

Исследуемые объекты (растительные консервы или части органов) измельчают, вносят в фарфоровые чашки, которые помещают на нагретую песочную баню, и высушивают исследуемую пробу. Затем при дальнейшем осторожном нагревании песочной бани обугливают эту пробу. Обуглившийся или превращенный в пепел биологический материал охлаждают, смачивают концентрированным раствором нитрата аммония или конц. азотной кислотой. Фарфоровую чашку помещают на кипящую водяную баню и высушивают ее содержимое, которое переносят в фарфоровый тигель вместимостью 30—50 мл, и осторожно нагревают на слабом пламени. При этом пламя не должно соприкасаться с дном тигля. Нагревание тигля производят таким образом, чтобы его содержимое постепенно превращалось в золу и не было вспышки. При неполном сгорании органических веществ зола в тигле имеет черный или серый цвет.

Для полноты сгорания содержимого тигля его смачивают концентрированным раствором нитрата аммония, высушивают на водяной бане и прокаливают. После этого тигель охлаждают, а к его содержимому прибавляют раствор соответствующей кислоты для переведения оксидов металлов в их соли. При исследовании полученного минерализата на наличие марганца золу обрабатывают соляной кислотой, а при исследовании на наличие меди — азотной кислотой. После обработки золы соответствующей кислотой содержимое тигля фильтруют. Фильтрат выпаривают на кипящей водяной бане досуха. Сухие остатки растворяют в 3—5 мл воды и полученные растворы исследуют на наличие катионов соответствующих металлов (марганца или меди).

Метод сплавления органических веществ с нитратами в хим.-токс. анализе применяется чаще, чем метод сухого озоления. Пользуясь методом сплавления, биологический материал или другие органические вещества нагревают с расплавленными нитратами щелочных металлов. С повышением температуры окислительные свойства нитратов усиливаются. При этом может происходить быстрое окисление органических веществ, сопровождающееся выбрасыванием из тигля мелких частиц сожженной пробы. Для предотвращения протекания слишком бурной реакции, которая может сопровождаться взрывом, при сплавлении применяют не нитраты, а их смеси с карбонатами щелочных металлов.

Выполнение сплавления. Метод применяется при исследовании (пилюли, органические соединения, содержащие металлы, остатки после выпаривания мочи, волосы, ногти и др.) на наличие мышьяка, серебра и некоторых других металлов.

1—2 г исследуемого объекта вносят в фарфоровую чашку, прибавляют 4—6 г смеси, состоящей из двух частей карбоната натрия и одной части нитрата натрия, перемешивают, смачивают водой и при нагревании на водяной бане высушивают досуха. В фарфоровый тигель вместимостью 30—50 мл вносят 5—6 г нитрата натрия. Тигель осторожно нагревают до полного расплавления нитрата натрия. Затем уменьшают пламя и в тигель небольшими порциями вносят высушенную в фарфоровой чашке смесь исследуемого объекта, нитрата и карбоната натрия. Каждую новую порцию этой смеси вносят в тигзль после сгорания предыдущей и перехода ее в расплавленное состояние.

После сжигания последней порции смеси в фарфоровую чашку, в которой находилась эта смесь, вносят 2—3 г карбоната натрия, хорошо перемешивают. Карбонат натрия вносят в тигель для сжигания исследуемой смеси. При сплавлении смеси пламя горелки регулируют так, чтобы в тигле не вспыхивало пламя и с выделяющимися газами не удалялось исследуемое вещество.

После сжигания всей смеси тигель охлаждают, а его содержимое обрабатывают кипящей водой. Полученный раствор применяют для обнаружения и количественного определения «металлических ядов».

метод непригоден для исследования объектов биол. происхождения на наличие соединений ртути, так как они улетучиваются при нагревании с нитратом и карбонатом натрия.

Дробный метод основан на применении реакций, с помощью которых в любой последовательности можно обнаружить искомые ионы в отдельных небольших порциях исследуемого раствора. Пользуясь дробным методом, отпадает необходимость выделения исследуемых ионов из растворов.

Деструкция — нарушение структуры биол. м-ла под влиянием азотной, серной и других кислот, обладающих окислительными свойствами, без полного разрушения органических веществ, переходящих в деструктаты. При деструкции твердых частиц биол. м-ла он разлагается и переходит в жидкую фазу (деструктат). При деструкции в качестве продуктов разложения твердых частиц биол. м-ла, переходящих в деструктат, являются молекулы белковых веществ и продукты их частичного кислотного гидролиза (пептиды и аминокислоты), липиды и некоторые другие вещества, входящие в состав тканей организма.

Денитрация — процесс освобождения минерализатов от азотной, азотистой, нитрозилсерной кислот и оксидов азота. На первых этапах применения метода разрушения органических веществ азотной и серной кислотами для денитрации минерализатов применялся так называемый гидролизный метод. Этот метод основан на разбавлении минерализатов водой и на последующем нагревании полученных жидкостей. При нагревании минерализатов, разбавленных водой, улетучиваются азотная, азотистая кислоты и оксиды азота, а нитрозилсерная кислота при указанных условиях практически не улетучивается. Она постепенно разлагается водой (гидролизуется).

Для денитрации минерализатов предложены мочевина, сульфит натрия и др. С помощью мочевины процесс денитрации минерализатов заканчивается за 3—5 мин (при 135— 145°С), а с помощью сульфита натрия — за 10—15 мин (при температуре выше 100°С).

метод денитрации минерализатов формальдегидом. выделяется азот:

4HNO3 + 5НСНО → 2N2 + 5СО2 + 7Н2О.

В результате взаимодействия азотистой кислоты с формальдегидом выделяются азот, оксид азота (II), оксид углерода (IV) и вода:

4HNO2 + 2НСНО → Ν 2 + 2ΝΟ + 2СО 2 + 4Н 2О.

Оксид азота (II) окисляется кислородом воздуха до оксида азота (IV), который при взаимодействии с водой дает азотную и азотистую кислоты:

ΝΟ + Ο → ΝΟ2

2ΝΟ2 + Н2О → ΗΝΟ2 + ΗΝΟ3

Образовавшиеся при этом азотная и азотистая кислоты реагируют с формальдегидом, как указано выше.

Нитрозилсерная кислота при нагревании с водой разлагается. Образовавшаяся при этом азотистая кислота реагирует с формальдегидом, как указано выше.

Для денитрации минерализатов, полученных при разрушении биол. м-ла азотной и серной кислотами, к ним прибавляют 10—15 мл воды. В эту жидкость, нагретую до 110— 130°С, осторожно по каплям прибавляют формалин (40 %-й раствор формальдегида). При этом наблюдается обильное выделение пузырьков газа (Ν 2 и NO), иногда имеющего оранжево-бурую окраску (ΝΟ 2 ). Процесс денитрации минерализатов формалином заканчивается за 1—2 мин. Для этой цели требуется от нескольких капель до нескольких миллилитров формалина. Избыток формальдегида, не вступившего в реакцию с азотной и азотистой кислотами, удаляют нагреванием жидкости в течение 5—10 мин.

Для проверки полноты денитрации минерализатов проводят реакцию с раствором дифениламина (0,5 г дифениламина растворяют в 100 г конц. серной кислоты и прибавляют 20 мл дистиллированной воды): При наличии азотной, азотистой кислот или оксидов азота в минерализате появляется синяя окраска. Эта реакция основана на окислении дифениламина азотной кислотой и продуктами ее разложения. Вначале при окислении дифениламина образуется бесцветный дифенилбензи-дин, при окислении которого образуется соединение, имеющее синюю окраску:

Денитрация считается оконченной тогда, когда реакция минерализата с раствором дифениламина будет отрицательной. Если от прибавления раствора дифениламина к минерализату он окрашивается в синий цвет, то денитрацию проводят повторно.

Выполнение минерализации. В колбу Кьельдаля вносят измельченного биол. м-ла, прибавляют смеси, состоящей из равных объемов концентрированных азотной и серной кислот и воды. Над колбой Кьельдаля в штативе закрепляют делительную воронку, в которой содержится конц. азотная кислота, разбавленная равным объемом воды. После этого начинают осторожно нагревать колбу. В течение 30—40 мин происходит деструкция биол. м-ла. При этом прозрачная жидкость в колбе приобретает желтую или бурую окраску. Затем колбу Кьельдаля с содержимым опускают на асбестированную сетку и усиливают нагревание. Для разрушения органических веществ из капельной воронки по каплям прибавляют концентрированную азотную кислоту, разбавленную равным объемом воды. Прибавление азотной кислоты регулируют так, чтобы из колбы не выделялись бурые пары оксидов азота. Минерализация считается законченной тогда, когда прозрачная жидкость (минерализат) при нагревании без добавления азотной кислоты перестанет темнеть, а над жидкостью будут выделяться белые пары серной кислоты.

Полученный минерализат охлаждают, воды и нагревают до 110—130°С, а затем осторожно по каплям (избегая избытка) прибавляют формалин. При этом отмечается обильное выделение бурых (иногда оранжевых) паров. После окончания выделения этих паров жидкость еще нагревают 5—10 мин, а затем к 1—2 капли прибавляют каплю раствора дифениламина в серной кислоте. Отрицательная реакция минерализата с дифениламином на азотную, азотистую кислоты, а также на оксиды азота указывает на окончание процесса денитрации. При положительной реакции минерализата с дифениламином денитрацию проводят повторно.

Минерализат, содержащий большинство катионов металлов, будет бесцветным. В минерализате могут быть катионы меди и хрома. В этом случае минерализат будет окрашен соответственно в синий или зеленый цвет. Если в биол. м-ле содержались барий и свинец, то в минерализате будут осадки сульфатов этих металлов.

Метод минерализации биол. м-ла азотной и серной кислотами имеет ряд достоинств. Минерализация происходит быстрее, чем методом разрушения биол. м-ла хлоратом калия и соляной кислотой, а также некоторыми другими методами. При минерализации биол. м-ла азотной и серной кислотами получаются относительно небольшие объемы минерализатов. Это обстоятельство оказывает влияние на чувствительность методов обнаружения «металлических ядов» в минерализатах.

Однако этот метод непригоден для изолирования ртути из биол. м-ла, так как значительные количества ее улетучиваются при нагревании биол. м-ла с серной и азотной кислотами.