2.2.3 Культура лимфоцитов человека

Культура лимфоцитов человека является одной из обязательных тест-систем при оценке влияния мутагенных факторов окружающей среды. Одним из достоинств этой тест-системы является то, что по наблюдаемым типам аберраций можно достаточно определенно идентифицировать тип мутагенного воздействия.

Культивирование лимфоцитов. Кровь отбирают из локтевой вены, помещают в стерильную пробирку, содержащую раствор гепарина (200 ЕД/мл крови). В стерильных условиях образцы крови переливают по 0,8 мл в приготовленные для культивирования флаконы Карреля с культуральной средой. Состав культуральной среды: 6,16 мл среды МЕМ; 1,6 мл инактивированной телячьей сыворотки; 0,08 мл L-глютамина; 0,08 мл р-ра антибиотика; 0,15 мл фитогемагглютинина. Флаконы помещают в термостат при 37 °С для инкубации клеток в течение 48 ч. Для блокирования митоза на стадии метафазы за 2 ч до окончания инкубации во флаконы добавляют раствор демеколцина в концентрации 0,2 мкг/мл среды.

Гипотонизация клеток. После окончания культивирования культуру клеток переливают в центрифужные пробирки и центрифугируют при 10007 об./мин в течение 15 мин для осаждения клеток. Надосадочную жидкость удаляют с помощью водоструйного насоса, добавляют предварительно подогретый до 37 °С гипотонический раствор (0,75 М KCl) и ресуспендируют в нем осадок. Далее пробирки с культурой клеток выдерживают на водяной бане (37 °С) 10-12 мин. По окончании гипотонизации вновь центрифугируют при тех же условиях с последующим удалением надосадочной жидкости.

Фиксация клеток. Для фиксации клеток осадок ресуспендируют в 1-1,5 мл свежеприготовленного фиксатора (смесь метилового спирта и ледяной уксусной кислоты в пропорции 3:1) на шейкере и доводят его объем до 10 мл. Смену фиксатора с последующим центрифугированием производят трижды.