2.2.3 Культура лимфоцитов человека
Культура лимфоцитов человека является одной из обязательных тест-систем при оценке влияния мутагенных факторов окружающей среды. Одним из достоинств этой тест-системы является то, что по наблюдаемым типам аберраций можно достаточно определенно идентифицировать тип мутагенного воздействия.
Культивирование лимфоцитов. Кровь отбирают из локтевой вены, помещают в стерильную пробирку, содержащую раствор гепарина (200 ЕД/мл крови). В стерильных условиях образцы крови переливают по 0,8 мл в приготовленные для культивирования флаконы Карреля с культуральной средой. Состав культуральной среды: 6,16 мл среды МЕМ; 1,6 мл инактивированной телячьей сыворотки; 0,08 мл L-глютамина; 0,08 мл р-ра антибиотика; 0,15 мл фитогемагглютинина. Флаконы помещают в термостат при 37°С для инкубации клеток в течение 48 ч. Для блокирования митоза на стадии метафазы за 2 ч до окончания инкубации во флаконы добавляют раствор демеколцина в концентрации 0,2 мкг/мл среды.
Гипотонизация клеток. После окончания культивирования культуру клеток переливают в центрифужные пробирки и центрифугируют при 10007 об./мин в течение 15 мин для осаждения клеток. Надосадочную жидкость удаляют с помощью водоструйного насоса, добавляют предварительно подогретый до 37°С гипотонический раствор (0,75 М KCl) и ресуспендируют в нем осадок. Далее пробирки с культурой клеток выдерживают на водяной бане (37°С) 10-12 мин. По окончании гипотонизации вновь центрифугируют при тех же условиях с последующим удалением надосадочной жидкости.
Фиксация клеток. Для фиксации клеток осадок ресуспендируют в 1-1,5 мл свежеприготовленного фиксатора (смесь метилового спирта и ледяной уксусной кислоты в пропорции 3:1) на шейкере и доводят его объем до 10 мл. Смену фиксатора с последующим центрифугированием производят трижды.
- Введение
- 1. Наночастицы
- 1.1 Состояние проблемы
- 1.2 Определение наночастиц
- 1.3 Классификация наночастиц
- 1.4 Свойства наночастиц
- 1.5 Пути поступления и биокинетика наночастиц
- 1.6 Системные эффекты наночастиц
- 1.7 Иисследование цитотоксичности наночастиц
- 2. Обьекты, методы исследований, приборы, оборудование
- 2.1 Наночастицы, используемые в экспериментах in vitro
- 2.1.1 Характеристика наночастиц серебра
- 2.2 Культуры клеток, используемые для изучения токсичности in vitro
- 2.2.1 Культура клеток карциномы легкого человека (А549)
- 2.2.2 Культура клеток амниона человека, сублиния FL
- 2.2.3 Культура лимфоцитов человека
- 2.2.4 Культура кардиомиоцитов крыс линии SHR
- 2.3 Методы изучения цитотоксичности наноматериалов в культурах клеток млекопитающих
- 2.3.1 Метилтетразолиевый тест
- 2.3.2 Метод оценки жизнеспособности клеток в культуре с помощью окраски трипановым синим (метиленовым синим)
- 2.3.3 Метод оценки жизнеспособности клеток в культуре с помощью определения активности ЛДГ
- 2.4 Перечень испытательного оборудования
- 3. Результаты исследований
- 3.1 Влияние наночастиц серебра на жизнеспособность клеток линий А549, SHR и сублинии FL по результатам МТТ-теста
- 3.2 Влияние наночастиц на жизнеспособность лимфоцитов человека по результатам МТТ-теста
- 3.3 Изучение цитотоксичности наноматериалов для клеток линии А549 с помощью окраски метиленовым синим
- 3.4 Изучение жизнеспособности клеток в культуре по активности лактатдегидрогеназы в среде культивирования
- Заключение
- Лабораторная работа № 3 Получение наночастиц серебра цитратно-сульфатным методом Кери-Ли
- Зависимость скорости формирования наночастиц серебра от концентрации ионов серебра.
- 4.Влияние наночастиц серебра на организм человека и окружающую среду.
- Наночастицы серебра убивают бактерии
- 1.2.1. Получение наночастиц серебра методом химического восстановления в растворах
- 1.2.1. Получение наночастиц серебра методом химического восстановления в растворах
- Глава 1. Обзор литературы
- 6.2. Токсичность