1.4 Методы исследования антиоксидантов

В настоящее время большинством авторов методы определения

антиоксидантной активности классифицируются: по способам регистрации проявляемой АОА (волюмометрические[14], фотометрические[15], хемилюминесцентные[16], флуоресцентные[17], электрохимические[18]); по типу источника окисления; по типу окисляемого соединения; по способу измерения окисленного соединения.

Однако наиболее известными методами определения антиоксидантной активности являются:

1 TEAC (trolox equivalent antioxidant capacity): метод основан на следующей реакции:

Метмиоглобин + Н₂О₂>Феррилглобин +ABTS>ABTS*+АО.

Метод определения эквивалентов Тролокса (TEAC) основан на способности антиоксидантов восстанавливать радикальные катионы 2,2-азинобиса (ABTS) и тем самым ингибировать поглощение в длинноволновой части спектра (600 нм). Существенным недостатком метода является двухступенчатая реакция получения радикала. Это удлиняет время проведения анализа и может увеличить разброс результатов, несмотря на то, что для анализа используют стандартизированный набор реактивов [19].

2 FRAP (ferric reducing antioxidant power): метод основан на следующей реакции:

Fe(III)-Трипиридитриазин+АО>Fe(II)-Трипиридилтриазин.

Железовосстанавливающая/антиоксидантная способность (FRAP)[20]. Здесь используется реакция восстановления Fe(III)-трипиридилтриазина до Fe(II)-трипиридилтриазина [21]. Однако этим методом невозможно определение некоторых антиоксидантов, например глутатиона. Этот метод позволяет прямое определение низкомолекулярных антиоксидантов. При низких рН восстановление Fe(III)-трипиридилтриазинового комплекса в Fe(II)-комплекс сопровождается появлением интенсивно голубой окраски. Измерения основаны на способности антиоксидантов подавлять окислительный эффект реакционных частиц, генерируемых в реакционной смеси. Этот метод отличается простотой, быстротой и небольшими затратами при исполнении.

3 ORAC (oxygen radical absorbance capacity): метод основан на следующей реакции:

Fe(II)+H₂O₂>Fe(III) + OH*+AO>OH* + Люминол.

Определение способности абсорбировать кислородные радикалы (ORAC). В этом методе регистрируют флуоресценцию субстрата (фикоэритрина или флуоресцеина), которая возникает в результате его взаимодействия с АФК. Если в исследуемом образце есть антиоксиданты, то наблюдают уменьшение флуоресценции по сравнению с контрольным образцом [23]. Первоначально этот метод был разработан доктором Гохуа Као в Национальном институте старения в 1992 г. В 1996 году доктор Као объединился с доктором Рональдом Прайером в совместную группу в Исследовательском центре старения USDA, где был создан полуавтоматический метод [24].

4 TRAP (total radical trapping antioxidant parameter) [25]: метод основан на следующей реакции:

AAPH+AO>AAPH* + ФЛ (ФЭ).

В этом методе используют способность антиоксидантов взаимодействовать с пероксильным радикалом 2,2- азобис(2-амидинопропан) дигидрохлорид (ААРН). Модификации TRAP состоят в способах регистрации аналитического сигнала. Чаще всего на завершающей стадии анализа перокси-радикал ААРН взаимодействует с люминисцирующим (люминол), флуоресцирующим (дихлорфлюоресцин-диацетат, DCFH-DA) или другим оптически активным субстратом.

В качестве стандарта для методов TEAC, ORAC и TRAP используют водорастворимое производное витамина Е - Trolox (6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбокси кислоту).

В последнее время для оценки антиоксидантной активности возрос интерес к применению электрохимических методов. Эти методы обладают высокой чувствительностью, быстротой анализа.

Оценку антиоксидантной активности некоторых пищевых продуктов проводят методом потенциометрии, основанном на использование свойства веществ-антиоксидантов участвовать в окислительно-восстановительных реакциях за счет енольных (-ОН) и сульфгидрильных (-SH) групп.

Определение антиоксидантных свойств растворов основано на химическом взаимодействии антиоксидантов с медиаторной системой, которое приводит к изменению ее окислительно-восстановительного потенциала. Электрохимическая ячейка представляет собой емкость, содержащую K-Na-фостфатный буферный раствор, медиаторную систему Fe(III)/Fe(II) и комплексный электрод до измерения окислительно-восстановительного потенциала. Антиоксидантную активность оценивают в г-экв/л.

Амперометрический метод определения антиоксидантной активности основан на измерении электрического тока, возникающего при окислении исследуемого вещества на поверхности рабочего электрода, находящегося под определенным потенциалом. Чувствительность амперометрического способа определяется как природой рабочего электрода, так и потенциалом, приложенном к нему. Предел обнаружения амперометрического детектора полифенолов, флавоноидов на уровне нано-пикограммов,при таких малых концентрациях меньшая вероятность взаимного влияния разных антиоксидантов при их совместном присутствии, в частности проявление явления синергизма. К недостаткам способа можно отнести его специфичность: в данных условиях не могут быть проанализированы антиоксиданты, которые сами окисляются или восстанавливаются в области потенциалов электровосстановления кислорода. К достоинствам способа можно отнести его экспрессность, простату и чувствительность [26].

Метод гальваностатической кулонометрии с помощью электрогенерированных окислителей - метод применим для анализа жирорастворимых антиоксидантов [27].

Разработаны различные способы определения аскорбиновой кислоты:

амперометрический способ с использованием алюминиевого электрода, модифицированного пленкой гексацианоферрата никеля (II), методом простого погружения в раствор;

способ твердофазно-спектрофотометрического и визуального тест-определения аскорбиновой кислоты с использованием в качестве индикаторного порошка ксерогеля кремниевой кислоты, модифицированного реактивом Вавеле и медью (II);

хемилюминесцентное определение аскорбиновой кислоты можно провести проточно-инжекционным методом по хемилюминесцентной реакции родамина В с церием (IV) в сернокислой среде [10].

определение аскорбиновой кислоты в диапазоне 10^-8-10^-3 г/см³ методом анодной вольтамперометрии в водных и водно-органических средах.

Наиболее распространенным является метод FRAP, так как он экспрессен, высокочувствителен. За последние несколько десятилетий было разработано большое количество разновидностей методик определения антиоксидантной активности методом FRAP(таблица 1).

Таблица 1 Развитие метода FRAP и его применение для определения антиоксидантной активности разных объектов[30]

Примечания: условно обозначено: ПИА-проточно-инжекционный анализ, TPTZ-трипиридилтриазин, DIP-2,2^,-дипиридил, PHEN-о-фенантролин, DPA-пиридиндикарбоновая кислота, FZ-феррозин, АК-аскорбиновая кислота, КТ-катехол, t-время экспозиции, мин.