4. Изучение белков методом изотахофореза

Подвижность белков в свободном растворе примерно на порядок ниже, чем подвижность небольших молекул. Например, для белков сыворотки крови при рН=8,6 она составляет 1,2-7,6 В*с. Поэтому изотахофорез макромолекул можно проводить в более коротких трубках, но вместе с тем при этом необходимо использовать какую-либо антиконвекционную среду (обычно крупнопористый полиакриламидный гель). В процессе изотахофореза белки могут достигать очень высоких концентраций, часто 5--10%. Это означает, что они собираются в очень узкие зоны, тесно прилегающие одна к другой, и поэтому их не удается различить даже с помощью весьма чувствительных УФ-детекторов. Для того чтобы разделить белковые зоны, Свендсен и Роуз применили амфолиты-носители, образующие линейный градиент подвижности. Отсюда вытекает, что среди этих амфолитов-носителей всегда есть такие, подвижность которых окажется промежуточной между подвижностями исследуемых веществ.

В ряде работ были подробно изучены параметры изотахофореза белков и показано, что амфолиты-носители способны выполнять роль пространственных разобщителей (спейсеров). Отрицательная сторона их применения заключается в том, что часть молекул амфолитов-носителей может обладать такими же подвижностями, как и отдельные исследуемые белки, что приведет к расширению белковых зон. Впрочем, иногда такое действие амфолитов оказывается полезным, так как некоторые белки при слишком высокой концентрации склонны выпадать в осадок. Применяют также и другие спейсеры, такие, как аминокислоты или слабые кислоты. Однако требуется провести еще очень большую работу, чтобы найти эффективные спейсеры, отвечающие предъявляемым к ним требованиям.

Для изотахофореза белков желательно использовать узкие трубки и проводить его в полиакриламидных гелях, не проявляющих по отношению к исследуемым веществам свойства молекулярного сита. Изотахофорез обладает почти таким же хорошим разрешением, как и диск-электрофорез или изоэлектрическое фокусирование. Изотахофореграммы белковых смесей очень похожи на картины изоэлектрофокусирования, так как компоненты таких смесей в кислотной системе разделяются главным образом в результате различий в значениях их ИЭТ. Преимущество же изотахофореза заключается в том, что в отличие от изоэлектрического фокусирования он не приводит к осаждению белков.

Изотахофорез был с успехом применен для получения гемоглобина человека, продуктов распада фибриногена, а также при изучении белков сыворотки крови и спинномозговой жидкости человека.